鐵蛋白

鐵蛋白的分子結構是由一層蛋白殼圍繞着鐵和磷酸鹽分子組成的鐵核，外徑12～13nm，分子量500kDa。從不同來源（如人、馬、牛蛙和細菌等）的鐵蛋白結構特徵來看，所有的鐵蛋白雖然在一級結構上變化很大（氨基酸序列相似性有時才達到14%），但本質上都有相同的體系結構。蛋白殼均為由24個亞基以高度對稱性方式組成的內空心結構，空心直徑約為8nm，其中的氫氧化鐵核中可積累多達4000個鐵原子且不影響蛋白表面和與其它分子的相互作用；蛋白亞基中包括亞鐵氧化的接觸反應位點和與溶劑進行交換的親水小孔。 ^[2] 

鐵蛋白具有耐稀酸（pH值2.0）、耐稀鹼（pH值12.0）、耐較高温度（70～75℃水温下不變性）等特殊性質。在很多研究中，就是利用鐵蛋白的這些特性，從動物組織中提純出該蛋白。 ^[2] 

蛋白質殼具有親水性，故鐵蛋白可溶於水並可溶於胞漿或血漿中，在細胞內、外液中均較穩定。鐵蛋白主要是存在於細胞質中，但是在脊椎動物的線粒體和細胞核也有發現，並且在昆蟲中是一種分泌蛋白。鐵蛋白是體內鐵的主要儲存形式，其在脾臟、肝臟、骨髓中含量最高，在其它組織血清、血細胞等中也有發現。 ^[2] 

動植物體內廣泛存在的一類貯存鐵的蛋白。在哺乳類動物的肝和脾中含量最多。其外徑約12~14nm，空囊腔徑長約6nm，外殼（即脱鐵鐵蛋白）由24個亞基組成，每個亞基約含163個氨基酸殘基，每個分子最多可結合4500個鐵原子。分子量約為450kd。結合鐵的鐵蛋白是“溶”於水的，血漿鐵蛋白的濃度與體內儲存的鐵成正比。 ^[3] 

近幾年來發現肝癌還含有一種酸性的異鐵蛋白，稱為癌胚異鐵蛋白，可能有助於早期診斷。肝癌患者治療有效者血清鐵蛋白下降，而惡化和再發者升高，持續增高則予後不良，故血清鐵蛋白測定可作為療效監測手段之一，特別是對AFP陰性的患者尤有意義。 ^[3] 

鐵蛋白是一種含鐵的蛋白質，廣泛存在於各種哺乳動物的臟器如肝、脾、腎和骨髓內，尤以脾臟和肝臟為多。馬脾臟含有最豐富的鐵蛋白，故一般均由馬脾臟內提取，並已結晶成功。它的特點在於含有約23%的鐵，以氫氧磷酸高鐵（ 分子量約為120，000）形式存在，有四個Fe(OH)₂顆粒，鐵在內部的分佈是均勻的，使鐵蛋自呈棕色。由於鐵原子具有很強的電子散射能力，故在電子顯微鏡下明顯地呈深暗色的膠粒結構，標記到抗體上以後仍可保持此特徵。 ^[4] 

鐵蛋白以肝、脾含量較高，其中馬脾臟含量最高，標記用的鐵蛋白主要是從馬脾臟中提取。馬脾臟來源不便，可用市售鐵蛋白相對分子質量45000。棕紅色結晶。商品為4次結晶品，懸浮於飽和硫酸銨溶液中。一種結合鐵離子輔基的蛋白質，它以脱鐵蛋白為外殼，環繞着4個分開的羥化鐵-磷酸鹽，形成電子緻密的結合型蛋白質。在製備的過程中，加入N，N-1，3-丙二胺偶合鐵蛋白，可成為正離子化鐵蛋白。密封、4℃保存。 ^[5] 

純化方法：①取1mL商品鐵蛋白溶液，用1000mL蒸餾水或1%的氯化鈉溶液透析3次，去除重結晶過程中殘留在鐵蛋白中的硫酸鎘。 ^[5] 

②200rpm離心10min，去除大的聚合物。 ^[5] 

③3000rpm離心1~2h，使其形成鐵蛋白小球，棄上清。 ^[5] 

④用結合反應所用的緩衝液懸浮沉澱。 ^[5] 

⑤馬脾鐵蛋白約含15%的低聚物，將鐵蛋白溶液過4B柱，收集流出液，取後2/3峯再過一次4B柱，可獲得98%的單體鐵蛋白。 ^[5] 

⑥用50%的飽和硫酸銨使鐵蛋白沉澱。然後將沉澱溶於少量雙蒸水中，通過透析去除硫酸銨。 ^[5] 

1、電鏡鑑定

將鐵蛋白水溶液滴在有Formvar膜的銅網上用3%磷鎢酸染色3min自然乾燥後電鏡下觀察可見含4個電子緻密區球型蛋白分子，外被蛋白外殼直徑12nm左右，內核7.5nm。 ^[5] 

2、抗體和鐵蛋白的結合

戊二醛作為偶聯劑效果較好，對抗體活性影響小。可分為一步法和二步法。 ^[5] 

戊二醛一步法：在0.9mL的0.1mol/L磷酸緩衝液（pH值7.0）中溶解15mg鐵蛋白和3mg抗體，加入0.1mL戊二醛，在37℃中放置24h，加入0.01mol/L賴氨酸中止反應，反應物加入0.02%NaN₃防腐。 ^[5] 

戊二醛二步法：在每毫升0.1mol/L磷酸緩衝液（pH值7.0）中溶解50~80mg鐵蛋白，加入戊二醛使其終濃度0.05%~0.15%，在37℃中放置2h後，過G-25柱，去除戊二醛，收集洗脱峯，按抗體，鐵蛋白1:5的比例，在37℃反應12h，加入0.01mol/L賴氨酸中止反應，反應物加入0.02%NaN₃。 ^[5] 

3、鐵蛋白標記抗體的純化

鐵蛋白標記抗體後的混合液中含一些未標記的抗體蛋白等，應儘量去除。純化方法：將標記的抗體複合物，在4℃的條件下加入1:3體積的飽和硫酸銨飽和度為25%，4000rpm離心15min，去上清將棕黃色標記的鐵蛋白沉澱溶於少量0.1mol/L磷酸緩衝（pH值為7.2），過G-25柱除鹽。 ^[5] 

4、鐵蛋白免疫電鏡標記流程

(1)電鏡包埋後標記樣品取材、固定、包埋和超薄切片同包埋後免疫電鏡操作流程。鐵蛋白標記的抗體分子量較大，較適合於細胞表面抗原的定位研究。 ^[5] 

(2)電鏡包埋前鐵蛋白標記細胞內抗原標記需對組織進行適當處理，以增強其通透性。多用包埋前間接染色法。孵育均在濕盒內進行。 ^[5] 

操作程序如下：①將組織標本製成10~15m厚片。 ^[5] 

②切片漂洗後，1%BSA孵育，室温30min。 ^[5] 

③特異性抗體（第一抗體）中室温60min或4℃孵育過夜。 ^[5] 

④PB充分漂洗3次，每次5min。 ^[5] 

⑤鐵蛋白標記的第二抗體孵育，室温30min。 ^[5] 

⑥漂洗同上，再經戊二醛固定1h。漂洗後，1%鋨酸後固定2h。其他步驟同常規電鏡。 ^[5] 

血清鐵蛋白是體內含鐵最豐富的一種蛋白質。肝、脾、紅骨髓及腸黏膜是鐵儲備的主要場所，約佔全身總鐵的66%。測定血清鐵蛋白是判斷體內鐵貯儲量的重要指標。在診斷缺鐵性貧血、鐵負荷過度、營養狀況調查等方面都有重要意義。鐵蛋白作為一種腫瘤標誌物，對臨牀某些惡性腫瘤的診斷也具有一定的參考價值。 ^[6] 

男性<322納克/毫升（ng/mL）；女性<219納克/毫升（ng/mL） ^[7] 

見於缺鐵性貧血、失血等。（無併發症）

鐵缺乏：男性<24μg/L，女性<11μg/L。 ^[1] 

見於惡性腫瘤、急性肝炎、急性感染、慢性腎病、血色素沉着症、戈謝病、慢性炎症性疾病等。

鐵過負荷：男性>336μg/L，女性>307μg/L。血色病鐵蛋白常>1000μg/L。 ^[1] 

血清鐵蛋白升高原因是鐵蛋白的來源增加或存在清除障礙。如患肝癌、肺癌、胰癌、白血病等時，癌細胞合成的鐵蛋白增加，使血清鐵蛋白升高。患肝病時肝細胞受損功能下降，使血清鐵蛋白升高。 ^[3] 

肝癌患者有鐵蛋白增高的原因可能是：

①肝癌細胞能合成和分泌鐵蛋白或異鐵蛋白。 ^[8] 

②肝癌組織對鐵蛋白的攝取及清除受到影響。 ^[8] 

③肝細胞損害壞死，貯存在肝細胞漿中的鐵蛋白溢入血中。血清鐵蛋白雖非特異性，但除肝癌、胰腺癌中度升高外，其它消化道腫瘤如食管癌、胃癌、直結腸癌均不升高。 ^[8] 

鐵蛋白偏高的症狀有以下幾點：

1、由於肝癌是肝臟細胞癌變，所以會出現肝區隱痛或間歇性的鈍痛或脹痛，上腹脹痛等。 ^[3] 

2、初期的肝癌症狀隱匿極深，往往只是出現食慾不振，上腹悶漲和乏力，B超檢查會出現輕度肝腫大。

3、四肢乏力，消瘦，全身衰弱易疲勞等症狀，中晚期往往通常是卧牀不起。 ^[3]