複製型

在未受照射的細菌中，複製位點(replicating site)或生長點開始於DNA分子的起始點，並且複製點圍繞環形分子半保留地發生複製。照射後，合餅應用溴尿嘧啶標記和氯化銫梯度離心的方法觀察到複製型與正常不同。在此方法中，用³H一胸腺嘧啶預先標記大腸桿菌幾個世代。預先標記的細胞或受照射或不受照射，然後用¹⁴C一溴尿嘧啶進行培養。摻入的¹⁴C放射性表現出與新複製的DNA部分有關。將細菌DNA進行氯化銫梯度離心時，3×10⁹道爾頓的DNA分子被分成平均大小為6×10⁶到1.6×10⁷道爾頓的斷片，根據浮力密度可分成三種類型的斷片。一型是輕的DNA(1.710)由兩條無溴尿嘧啶標記的鏈組成，另一型是混合DNA(1.754)由一條溴尿嘧啶標記的鏈和一條無溴尿嘧啶標記的鏈組成，第三型是重DNA(1.800)由兩條溴尿嘧啶標記的鏈組成。

在未受照射的細菌中，¹⁴C放射性出現於混合峯的位置，並且在一個世代期間隨着時間而增加。以後，在混合峯和重峯兩者均可見到¹⁴C放射性。這反映了正常細菌的一種半保留線性的複製型。但是，受照射的細菌，在照射後前10分鐘¹⁴C放射性首先出現於輕峯和混合峯之間的中間區域(即有限的複製)。到20分鐘時和以後，¹⁴C在混合峯中大量地出現，同時也開始在重峯中出現(即重複複製)，比未受照射細胞在重峯中出現早得多。即使重峯形成時，在照射細菌中仍保留一個輕峯 ^[1]  。

受照射細菌的複製型可解釋如下。照後即刻短時間內，細菌能使已開始複製的DNA繼續進行復制，但不能開始新的複製。將細菌放到缺乏氨基酸的培養基或氯黴素中，可觀察到相似的中間峯，這一情況支持了上述設想。在此條件下，蛋白質合成受抑制，而只有已經複製的DNA能繼續複製。這與由一個無溴尿嘧啶的鏈和一個部分有溴尿嘧啶標記及部分無溴尿嘧啶標記混合的鏈組成的DNA的中間密度也是一致的。此類型的複製稱為“有限的複製”。但是，20分鐘以後細菌仍可再開始複製。由於蛋白質合成受抑制，可影響DNA合成的開始複製，故新蛋白質的合成，如複製點的蛋白質合成，對DNA複製的開始非常重要。推想DNA複製的啓動或生長點是受染色體其它位點的遠距離控制。在已複製的DNA部分(混合部分)中已形成複製點時，從這些點複製的一些DNA可包含兩條溴尿嘧啶標記的鏈或重DNA。這稱為“重複複製”。在照射時複製點的區域也觀察到重複複製。這種障礙可使DNA的某個部分的複製受抑制或延遲，因而造成照射細菌中持續存在一個輕峯 ^[2]  。

複製型轉座(replicative transposition)是將供體的轉座元件複製一份，插入到受體的靶位點。每轉座一次，轉座元件的拷貝數就增加一個。複製型轉座又可分作兩類，一類不需要RNA中間物，另一類需要RNA中間物。

在不需要RNA中間物的複製型轉座過程中，轉座子一般由Y2一轉座酶催化進行滾環複製。使用此途徑進行復制的轉座子有IS91和Helitron，轉座過程一般有兩種機制。一種機制的複製和插入分開進行，具體步驟如下：①轉座酶切開轉座子起點處的一條鏈，酶的Tyr—OH與切口的5‘—磷酸基以酯鍵連接，切口的另一側為遊離的3‘—OH。②以3’—OH作為引物，開始鏈取代合成。③鏈取代合成達到轉座子的終點，轉座酶在終點處切開同一條鏈，遊離出單鏈轉座子。④新合成DNA鏈的3’—OH親核進攻轉座子終點5‘—磷酸基與酪氨酸形成的酯鍵，形成磷酸二酯鍵，並釋放出轉座酶。⑤轉座酶在受體分子的靶位點上切開DNA的一條鏈，酶與5‘—磷酸基形成酯鍵，並釋放出遊離的3’—OH。⑥被遊離出來的單鏈轉座子用3’—OH親核進攻靶位點上5‘—磷酸基與酶形成的酯鍵，同時，受體分子靶位點上的3’—OH也親核進攻單鏈轉座子上5‘—磷酸基與酶形成的酯鍵，將單鏈轉座子插入到靶位點。隨後，在靶位點的另一條鏈上進行DNA的修復合成，生成轉座子的互補鏈。

另一種機制的複製與插入是同時進行的，具體步驟如下：①轉座子的起點和靶位點同時被轉座酶切開，酶的兩個酪氨酸一OH分別與兩個5‘—磷酸基形成酯鍵，釋放出兩個遊離的3’—OH。②靶位點上的3’—OH進攻轉座子起點上5‘—磷酸基與酪氨酸形成的酯鍵，形成連接靶位點和轉座子起點的磷酸二酯鍵。③以轉座子起點的3’—OH為引物，開始DNA鏈的取代合成，在供體分子上合成轉座子的一條新鏈。④轉座酶在供體分子轉座子終點處的剪切，使供體分子單鏈轉座子的3’—OH遊離出來，並進攻受體分子上5‘—磷酸基與酪氨酸形成的酯鍵，使供體分子的單鏈轉座子完全插入到靶位點上。⑤受體分子通過DNA的修復合成，生成轉座子的互補鏈。

上述兩種機制的結果是相同的，在轉座過程中，轉座子複製1次，在供體分子和受體分子上各有一條新合成的鏈。

逆轉錄轉座子都需要RNA中間物，但LTR逆轉錄轉座子和無LTR逆轉錄轉座子在轉座的具體步驟上有很大的差別。

LTR逆轉錄轉座子進行轉座時，形成cDNA的過程與逆轉錄病毒合成cDNA相同，雙鏈cDNA通過剪切一黏接轉座插入靶序列。無LTR逆轉錄轉座子的轉座過程較複雜，以LINE為例，轉座的基本過程如下：①在RNA polⅡ的催化下，由LINE-DNA轉錄生成LINE-mRNA。②LINE-mRNA進入細胞質，翻譯生成逆轉錄酶和內切核酸酶。③LINE-mRNA與翻譯產物一起返回細胞核，結合到受體DNA富含T的靶位點，複合體中的內切核酸酶在靶位點切開DNA的一條鏈，產生3'—OH和5‘—磷酸基，並形成RNA—DNA雜合分子短片段。④逆轉錄酶在靶位點的3'—OH上，以LINE-mRNA為模板，啓動逆轉錄，開始合成cDNA的第一條鏈。⑤靶位點上的第二條鏈被內切酶或宿主細胞內的核酸酶切開，產生3'—OH和5‘—磷酸基。新合成的cDNA第一條鏈與靶位點上的另一條鍊形成雙鏈短片段，以靶位點上的3'—OH為引物，合成cDNA的第二條鏈。⑥靶位點上的缺口被宿主DNA聚合酶填補，最終在受體DNA中新插入一個LINE ^[3]  。

將目的基因仍保留在染色體以外的克隆系統稱為複製型基因克隆系統，以區別整合到染色體上的整合型克隆系統。儘管有大量不同的噬菌體，但所有已知的乳球菌複製型克隆系統都是由質粒構建的。

乳球菌遺傳學研究證明，乳球菌含有數量不等的質粒，多則十幾個。它們當中一些編碼重要的代謝物質，為了分析和克隆這些基因，以及瞭解它們的命運，應當消除其內源性質粒。儘管有大量的質粒存在於乳球菌中，但許多質粒是隱蔽性的，這就推遲了內源性質粒在載體構建中的應用，同時由於一些相關的革蘭氏陽性菌發展的載體也可在乳球菌中複製，並表達它們的抗性標記。因此，有兩種本質不同的載體可以成功的用於乳球菌，它們分別用外源性的複製子和遺傳背景清楚的乳球菌複製子構成，這兩種不同的載體列於圖1 ^[4]  。