血藍蛋白

它是在某些軟體動物、節肢動物（蜘蛛和甲殼蟲）的血淋巴中發現的一種遊離的藍色呼吸色素。血藍蛋白含兩個直接連接多肽鏈的亞銅離子，與含鐵的血紅蛋白類似，它易與氧結合，也易與氧解離，是已知的惟一可與氧可逆結合的銅蛋白，氧化時呈青綠色，還原時呈白色。其分子量450 000～1300 000。節肢動物的血藍蛋白一條多肽鏈與一分子氧結合，含銅量0．17%；軟體動物的血藍蛋白一條多肽鏈則與6分子氧結合，含銅量0.025%。銅以二價形式與蛋白直接結合。血藍蛋白有多種催化作用，特別是變性後，在特定條件下具有多酚氧化酶、過氧化氫酶和脂氧化酶等活性。

在一些無脊椎動物中，多數動物的血液不含血紅蛋白，如軟體動物（頭足動物和石鱉屬等）以及節肢動物（蝦、蟹及肢口綱的鱟）所含的是血藍蛋白（亦稱為血藍素）。血藍蛋白分子由1個Cu+和約200個以上氨基酸的肽鏈結合而成，和血紅蛋白一樣，該呼吸色素的顏色也與其狀態有關，在氧和狀態下為藍色，在非氧和狀態下則為無色或白色。

關鍵詞：載氧功能；抗病毒活性；抗菌活性；凝血功能

血藍蛋白是節肢動物和軟體動物血淋巴中的含銅呼吸蛋白，脱氧狀態為無色，結合氧狀態為藍色。分子質量一般為50 ku～75 ku，由7個或8個功能單位組成圓柱形結構。組成血藍蛋白的亞單位數目較多，每個亞單位都含有2個Cu（分子），含有10個～20個亞單位，每個亞單位（分子質量為350 ku～450 ku）有7個～8個功能單元（氧分子結合部位）。節肢動物血藍蛋白由六聚體或多個六聚體組成，分子質量約為3.5×103 ku，每個亞單位（分子質量為7.5 ku）含有一個氧閤中心。血藍蛋白的主要生物學功能與機體內的輸氧有關，它與血紅蛋白（hemoglobins）和蚯蚓血紅蛋白（hemerythreins）並稱為動物界中的3種呼吸蛋白。但近年的研究表明，血藍蛋白是一種多功能蛋白，它不僅具有輸氧功能，而且還與能量的貯存、滲透壓的維持及蜕皮過程的調節有關。特別引起學術界重視的是，血藍蛋白還具有酚氧化物酶活性和抗菌功能，被認為是節肢動物和軟體動物中的一種重要的免疫分子。

血藍蛋白是蝦血淋巴中的含銅呼吸蛋白，每個氧結合位點有2個銅原子，其氧的結合位點與另一種銅離子結合蛋白——酚氧化酶的氧結合位點的結構具有很高的相似性。血藍蛋白在脱氧狀態為無色，結合氧為藍色。

柱結合聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）及電鏡技術，研究中國鱟魚血藍蛋白（hemocyanin）的結構特點，結果表明經Sephadex G­100純化的血藍蛋白在PAGE電泳中出現4個條帶，純化的血藍蛋白再經DEAE­32層析得到5個洗脱峯，每個峯在PAGE電泳下可分辨出4個條帶，電鏡下，血藍蛋白分子出現環形、五角形、十字形和蝴蝶結形等構型並與其他解離的中間的構型同時存在。

節肢動物門的螯肢類、甲殼類、多足類和蜘蛛中都含有血藍蛋白，其中最大的類羣昆蟲雖不存在血藍蛋白，但含有與血藍蛋白有同源關係的六聚蛋白（hexamer）。六聚蛋白又分為富含芳香族氨基酸的和富含甲硫氨基酸的兩個類羣。在節肢動物的近親有爪類（Onychophora）中也發現了節肢動物類型的血藍蛋白。節肢動物類型的血藍蛋白有四級結構和三級結構。血藍蛋白的三級結構，分子質量約為75 ku，其中第2個域為α螺旋區，螯合1對Cu+，可結合1個O2，下方為第3個域，由β摺疊塊構成並含有Ca離子，功能尚不詳。

節肢動物血藍蛋白至少已分化成為：①酚氧化酶原（prophenoloxidase）；②昆蟲的六聚蛋白（hexamer），不螯合Cu+，為貯藏蛋白；③甲殼類的假血藍蛋白（pseudohemocyanin或cryptocyanin），也為貯藏蛋白；④雙翅類的六聚蛋白受體。經分子系統學的分析，它們與血藍蛋白相聚，共同構建了節肢動物血藍蛋白基因超家族。

血藍蛋白是以一價銅離子作為輔基的蛋白質。它存在於軟體動物（如章魚、烏賊、蝸牛等）和節足動物（如螃蟹、蝦、蜘蛛，鱟等）的血液裏。血藍蛋白的生理功能是輸氧。氧合血藍蛋白的銅是Cu（Ⅱ）並呈藍色，在347 nm附近有吸收峯，這是由扭曲四面體場中的d­d躍進產生的。脱氧血藍蛋白呈無色。X射線衍射技術大大增加了人們對血藍蛋白的認識。雖然目前仍未測出軟體血藍蛋白的晶體結構，但為節肢動物血藍蛋白的晶體結構分析提供了血藍蛋白分子活性部位的結構信息。龍蝦血藍蛋白亞單位由3個結構區域組成。區域Ⅰ為蛋白的前175個氨基酸殘基組，有大量的α螺旋二級結構；區域Ⅱ大部分也為α螺旋二級結構，由225個氨基酸殘基（176個～400個）和作氧分子鍵合部位的雙銅離子組成；剩餘的258個氨基酸殘基（401個～658個）構成區域Ⅲ，並且類似於如超氧化物歧化酶等其他蛋白的β摺疊二級結構。在區域Ⅱ的雙銅活性中心中，每個銅離子與3個組氨酸殘基的咪唑氮配位。未氧合時，2個銅離子相距約46 pm，相互作用很弱，沒有發現2個銅離子之間存在着蛋白質本身提供的橋基。此時，每個銅離子與3個組氨酸殘基咪唑氮的配位基本上是三角形幾何構型。氧合後，Cu（Ⅱ）為四配位或五配位，兩個銅離子與兩個氧原子（過氧陰離子）和6個組氨酸殘基中最靠近銅離子的4個組氨基酸殘基咪唑氮強配位。此時，在一個近似的平面上，每個銅離子呈平面正方形幾何構型，這是Cu（Ⅱ）最有利的配位狀況。氧分子以過氧橋形式在連接兩個Cu（Ⅱ），兩個Cu（Ⅱ）相距約36 pm。

化學家對合成血藍蛋白的模型化合物頗感興趣。1978年Simmons M G和Wilson L J合成了以咪唑作為配體的Cu（Ⅰ）配合物，在室温下無論是溶液或固體都能可逆載氧。用2,6­二乙酰基吡啶與組胺縮合，得到配體2,6­[1­；（2­；咪唑­4­亞乙基亞氨基）乙基]吡啶，然後在氮氣保護下加入[Cu（Ⅰ）（MeCN）4]（ClO4）得到暗紅色的[Cu（Ⅰ）]

該配合物在溶液中以單體形式存在。Cu（Ⅰ）離子的配位數為5。在室温下露置於空氣中，溶液迅速從紅色變為綠色，約2 min後反應完全，每2 mol Cu（Ⅰ）吸收1 mol O2。如果把載氧後的溶液温熱至40 ℃左右並用氮氣趕跑氣體，或在減壓下攪拌溶液，很容易發生放氧逆反應，溶液恢復原來的紅色。如此重複實驗證實它能可逆載氧。據此推測可能存在下列反應LCuⅠ + O2??LCuⅡO LCuⅡO + CuIL??LCuⅡO CuⅡL

血藍蛋白具有非特異性抗病毒作用。應用親和層析從斑節對蝦（白斑桿狀病毒（White spot syndrome virus ，WSSV））和虹彩病毒（質譜分析鑑定為血藍蛋白），將血藍蛋白和病毒混合後添加到細胞培養液，培養3 d後發現細胞只受到較輕微的破損。而不含血藍蛋白的對照組細胞則完全裂解。如果延長培養時間，試驗組細胞也相繼裂解。隨後選用6種DNA 或RNA病毒（SGⅣ、FV3、LDV、ThRV、ABV和IPNV）進行分析，結果發現其半抑制濃度（Semi­inhibitory concentration，ECs）約為4.56 mg/L～6.64 mg/L。這些結果表明，血藍蛋白在低濃度時是潛在的病毒抑制物，但血藍蛋白不能完全抑制病毒的複製。

研究發現血藍蛋白的兩個亞基在免疫功能上有很大差異，Lei K Y等報道，血藍蛋白的兩個分子質量73 ku和75 ku的亞基，只有75 ku的PjHcL亞基具有抗病毒功能，PjHcY亞基不具有抗病毒功能，它意味着這兩個血亞基可能起不同的角色。從序列和結構的比較發現，儘管這兩個亞基是高度保守的，它們表現出一定的差異在N端域和C端域。比對兩個亞基的氨基酸結構發現，在銅離子結合位點及第2功能區兩個亞基結構完全相同，只有在第3功能區PjHcL亞基和PjHcY亞基的氨基酸α、β構型不同。Lei等採用RT­PCR技術精確驗證了這一結果，並且發現了兩個亞基的不同免疫功能，為以後研究血藍蛋白的免疫學功能提供了更明確的依據。

總之，血藍蛋白的免疫防禦功能是近年來無脊椎動物免疫學領域的最新發現，在免疫反應中，僅可表現出酚氧化酶的功能，而且可裂解產生不同分子質量大小的抗菌片段以抵禦病原的入侵。雖然其免疫機理目前尚不十分明確，但隨着無脊椎動物上的演變相信其確實情況必將闡明。

近年來國內外研究表明，血藍蛋白及其裂解片段具有多種免疫功能。章躍陵以採自汕頭的南美白對蝦為研究對象，採用親和層析、PAGE、SDS­PAGE、Western blot、血細胞凝集試驗和糖抑制試驗等方法探索南美白對蝦血藍蛋白的血細胞凝集活性。結果發現，血藍蛋白對試驗所選用的魚、雞、鼠和人等4種紅細胞均具有顯著的血細胞凝集活性，凝集活性大小為5 mg/L～10 mg/L，而且其凝集反應可被α­；半乳糖、α­D葡萄糖、甘露醇和N­乙酰神經氨酸等4種糖所顯著抑制。不過，與一般的凝集素相比，血藍蛋白的凝集活性大概低1個～2個數量級，它在蝦血清中含量上的豐富也許可以彌補其凝集活性上的不足。既往研究中，發現血藍蛋白蛋白斑點的肽質量譜峯值可以與流感病毒的血凝素相匹配，其序列覆蓋率為37%。由此推測，血藍蛋白確實具有血細胞凝集活性，這對進一步研究血藍蛋白的免疫學功能具有重要意義。

研究證實，血藍蛋白可能由酚氧化酶進化而來，酚氧化酶級聯繫統的激活又與甲殼動物體內凝血蛋白的凝血機制緊密相關。研究發現血藍蛋白也具有凝集活性。這些研究結果提示，血藍蛋白、酚氧化酶及凝血蛋白可能是由同一蛋白進化而來，而血藍蛋白這一多功能分子卻保留了它們全部的免疫學功能。

血藍蛋白裂解產生的抗微生物肽與對蝦的免疫反應有關。近來又在大西洋白對蝦和凡納對蝦的血淋巴中分離到3種帶負電荷的抗真菌活性肽類，與血藍蛋白C端序列的一致性達95%～100%。當對蝦被感染後，血淋巴中這種血藍蛋白C端序列的活性肽濃度升高，這表明血藍蛋白的裂解是由生物學信號引起的。Lee S Y等從淡水螯蝦血漿中得到一種由16個氨基組成的抗菌肽，能抑制G+和G－細菌的生長。這種抗菌肽是血藍蛋白在酸性條件下經蛋白酶剪切產生。注射脂多糖和葡聚糖可促進血藍蛋白產生和釋放這種肽。這説明抗微生物肽可以被誘導、釋放和激活，從而在肌體的免疫防禦中起作用。Zhang Y L等還在凡納對蝦血清中分離到一種能與羊抗人IgG特異性反應的IgG樣蛋白，經檢測為血藍蛋白。研究發現，除銅結合位點外，在此血藍蛋白的C端還存在一個由252個氨基酸組成的似Ig的保守區域。此外，還在血藍蛋白和Ig的重鏈和k鏈分別發現4個和1個相似保守區域。很有可能這些相似Ig的保守區域賦予了甲殼動物呼吸色素新的功能，使其更好地發揮抗微生物作用。雖然到目前為止，血藍蛋白的加工機制還不十分清楚，但它們在甲殼動物免疫系統中所起的作用不容忽視，因此進行深入細緻的研究，搞清楚其免疫機制，對於甲殼類經濟動物的疾病控制是至關重要的。

近年來，隨着血藍蛋白多種功能的不斷髮現，特別是免疫活性的發現，血藍蛋白的功能、作用機理、進化地位已經引起各國學者的濃厚興趣。進一步研究血藍蛋白功能對於豐富和發展無脊椎動物，特別是甲殼類動物生理生化和免疫系統的基礎研究，探索免疫這些結果表明，血藍蛋白具有廣譜抗細菌、真菌、病毒功能及獨特的作用機理，有可能成為抗菌、抗病毒及抗腫瘤藥物的新來源。中國是海洋大國，開發和利用海洋動物血藍蛋白資源，將為研製抗菌新藥提供理想分子設計骨架和模板，為發展新的抗感染藥物奠定重要基礎。此外，蝦類血藍蛋白的研究加深了人們對低等脊椎動物免疫防禦機制的認識，為日益嚴重的蝦類病害防治開闢了嶄新的途徑。同時，隨着蝦類轉基因技術的發展，人們有可能通過轉血藍蛋白基因獲得抗病新品種。可以相信，隨着研究的不斷深入，蝦類血藍蛋白將對世界水產漁業的可持續發展起到重要的作用。