蛤素

蛤素是由有毒甲藻產生的脂溶性毒素，已經確認的同系物有14種。在不同國家的不同貝類中蛤素組成特徵和含量均存在差異。蛤素的小鼠腹腔注射毒性大於經口毒性。國際上蛤素的食用安全限量標準尚不統一。蛤素的總量可用生物法測定，每種蛤素組分的含量可用液相色譜-質譜法測試。蛤素的酶聯免疫測定方法正在研究階段。2004年世界糧農組織（Food and Agriculture Organiza-tion of the UnitedNations，FAO）、世界衞生組織（World Health Organization，WHO）和聯合國教科文組織海洋科學委員會（Intergovernmental Oceanographic Commission ofUNESCO，IOC）根據貝類毒素的化學分子結構把毒素分為8類（Toyofukuet al.2006），蛤素是其中的一類。蛤素由鰭藻屬Dinophysissp.產生（Yasumotoetal.2006；Daigujietal.1998；Wilkinsetal.2006；Draiscietal.1996；Jameset al.1999；MacKenzieet al.2002、2005；Mileset al.2006；Fernandezet al.2006），屬脂溶性環狀聚醚化合物，20世紀80年代被發現。 ^{[1-3]  [4]  [5]  [6-7]} 

20世紀80年代，日本科學家Yasumoto等（1985）從日本蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis的肝胰腺（Hepatopancreas）中分離出來，並因此命名為蛤素。隨後，從藻類和貝類中分離並確認了一系列蛤素同系物，並證實蛤素毒性由微藻產生，貝類可以通過濾食有毒藻而富集蛤素。 ^{[5]  [8]} 

蛤素是脂溶性環狀聚醚化合物，可溶於有機溶劑，但有些有機溶劑（如乙腈）可造成毒素分子結構的變化（Sasakiet al.1998），在強鹼性條件下，分子結構易被破壞（Blancoet al.2005）。現已確認的蛤素的同系物有14種，其中1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13和14的分子結構已經確定，5和10尚未報道（Larsenet al.2007）。MERCENENE-4與MERCENENE-1互為空間異構體，MERCENENE-4也稱為7-epi-MERCENENE-1。MERCENENE-6與MERCENENE-7互為空間異構體，MERCENENE-7也被稱為7-epi-MERCENENE-6。MERCENENE-8和MERCENENE-9分別是MERCENENE-1/4和MERCENENE-6/7酸化的產物。不同於MERCENENE-2的環鏈結構，MERCENENE-2 SA和7-epi-MERCENENE-2 SA具有開鏈結構。MERCENENE-11（Suzukiet al.2006）、MERCENENE-12（Miles etal.2004）、MERCENENE-13（C32位α基MERCENENE-12）和MERCENENE-14（C32，C26位脱氫MERCENENE-13）（Mileset al.2006）的分子結構也已確定。部分蛤素在貝類中以開鏈脂肪酸酯的形式存在（Wilkinset al.2006）。蛤素同系物分子結構的差異表現在4個方面：（1）在43位的甲基的氧化程度不同，從低到高分別為甲基、羥基和羧基；（2）A環和B環的同分異構化；（3）環鏈聚醚和開鏈脂肪酸的差異；（4）遊離蛤素和蛤素脂肪酸酯的差異。 ^[9-13] 

澳大利亞分別在1997年和2001年報道了兩起因食用含蛤素的貝類而造成的中毒事件（Quilliamet al. 1998）。但後續研究表明，中毒現象更可能是由其他種類的毒素所導致（Mileset al.2007）。食用含有蛤素的貝類不會造成消費者急性中毒。在小鼠體內毒性試驗中，以腹腔注射的方式，MERCENENE-1、MERCENENE-2、MERCENENE-3、MERCENENE-4、MERCENENE-7和MERCENENE-11最小致死量範圍從192μg/kg至770μg/kg小鼠體重，MERCENENE-8、MERCENENE-9和MERCENENE-2 SA最小致死量高於5000μg/kg小鼠體重（Mileset al.2007）。日本的研究表明，在MERCENENE-2的口服劑量為1500μg/kg小鼠體重時，小鼠未產生腹瀉症狀，但造成小鼠小腸積水。當劑量為2000μg/kg小白鼠體重時，小鼠產生腹瀉症狀。然而在新西蘭的研究中，當MERCENENE-2（Mileset al.2004）或MERCENENE-11（Suzukiet al.2006）的口服劑量達到5000μg/kg小鼠體重時，小鼠未產生腹瀉。在體外毒性試驗中，當劑量為1.8μg/L時，MERCENENE-2 SA對KB細胞沒有毒性，而MERCENENE-2在0.05μg/L時對KB細胞就有毒性作用。由此推斷，MERCENENE-2的毒力與其環狀分子結構有關（Daigujietal.1998）。 ^{[3]  [14-15]} 

蛤素通常和大田軟海綿酸（OA）、鰭藻毒素（DTXs）同時出現在貝類和藻類組織中，並且可以使用相同的方法從貝類和藻類中提取出來。通過腹腔注射的方法，高劑量蛤素可以致小白鼠腹瀉甚至死亡。因此傳統上蛤素被歸類為腹瀉性毒素（Yasumotoet al.1985）。但是，蛤素與軟海綿酸在毒性機理上有很大不同，軟海綿酸是蛋白磷酸酯酶抑制劑，而蛤素對蛋白磷酸酯酶沒有抑制作用。因此，趨向於將蛤素列為單獨的一類毒素（Toyofukuet al.2006）。 ^{[16]  [17]} 

大多數國家沒對貝類中的蛤素做出單獨的限量要求。歐盟規定雙殼貝類可食性組織中腹瀉性貝毒不大於160μg/kg（以OA計）。腹瀉性貝毒包括OA、DTX-1、DTX-2。小白鼠生物法可以測試腹瀉性貝毒素總量，不區分毒素的組份。由於不同國家的研究結果不一致，對MERCENENE的毒性仍存在歧義。2004年，WHO/FAO/IOC的專家組認為：“由於蛤素的毒理學數據不充分，無法建立蛤素的每日最大允許攝入量（Tolerable Daily Intake，TDI）”。2005年，歐盟專家建議把720μg/kg作為貝肉中蛤素（不包括MERCENENE-8，9，10）的限量標準。 ^[18-19] 

研究表明，蛤素是由鰭藻Dinophysisspp.產生的，常見的產毒藻有弗氏鰭藻D. fortii，急尖鰭藻D.acuta、漸尖鰭藻D. acuminata、具尾鰭藻D. caudata、圓形鰭藻D. Rotundata和斯堪的納維亞鰭藻D. nor-vegica等（Larsenet al.2007；Suzukiet al.2003；Mileset al.2004；Draisciet al.1996；Jameset al.1999；Leeet al.1989；MacKenzieet al.2002、2005；Mileset al.2006；Suzukiet al.2001）。 ^{[4]  [16]} 

在日本和意大利的D. fortii中都檢測到MERCENENE-2（Yasumotoetal.1985；Draiscietal.1996）。在新西蘭渦鞭毛藻P. reticulatum的每個藻細胞中的MERCENENE-2、MERCENENE-11、MERCENENE-2 SA和MERCENENE-11 SA含量分別為81.0、22.0、1.9和1.0pg。D. acata的每個藻細胞中的MERCENENE-2、MERCENENE-11、MERCENENE-2 SA和MERCENENE-11 SA含量分別為82.0、47.0、3.0和0.5 pg。在P. reticulatum和D. acata中，MERCENENE-2和MERCENENE-11含量較高，而開鏈脂肪酸MERCENENE-2 SA和MERCENENE-11 SA含量較低（MacKenzieet al.2002）。在中國黃海、東海、渤海和南海區均發現有鰭藻屬（Dinophysissp.）D. Fortii，D. acuminta，D.caudat，D.rotunda，D.mitra和D.miles。黃海膠州灣水域，李偉才等（2000）在1994年6月份觀測到海水中存在漸尖鰭藻D. acuminta，數量達200~800個/m3。 ^[20-21] 

用小白鼠生物學方法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）測試腹瀉性貝毒素最早是由日本學者確立的（Yasumotoetal.1978）。其具體步驟為：取適量均質後的貝類樣品，以丙酮提取後離心，丙酮提取液以氮氣吹乾後加入乙醚溶解，以水洗醚相，棄去下層水相，醚相吹乾後加入含1%吐温-60的生理鹽水製成注射液。分別取0.5和1.0ml注射液原液和4倍、16倍體積稀釋後的注射液，每組腹腔注射3只ICR系小白鼠，觀察24h內死亡兩隻以上的組，查表確定毒性的劑量，單位為鼠單位（MU）。受小白鼠性別、品系、個體大小差異等的影響，生物學方法測試結果的重複性和精度都較差（Nagashimaet al.1991；Stabellet al.1992；Parket al.1986），因為丙酮提取物中可能含有多種脂溶性貝毒素，如OA、DTX-1、DTX-2和MERCENENE-1、MERCENENE-2等，所以小白鼠生物法測試的是脂溶性腹瀉性貝毒素總量，不能區分毒素的組份特徵。同時由於每年大量使用小白鼠用於貝類毒素的日常檢驗，在學術界已引起是否有違科研道德的爭論（Hesset al.2006）。由於以上原因，在一些國家已限制使用該方法。 ^{[22-23]  [24]} 

液相色譜測試技術（LC–MS/MS）需要用毒素標準品作對照，而毒素標準品的缺乏，限制了液相色譜的應用。液相色譜-質譜聯用技術很好地解決了這一問題。其原理是利用液相色譜將不同類型的毒素分離，利用質譜檢測器，對不同的毒素進行檢測。即使沒有毒素標準品，只要知道這種毒素的分子量，就可對其進行定性分析。有毒素標準品時，液相色譜-質譜聯用分析技術也可對毒素進行精確的定量分析（Quilliamet al.1998；Quilliam　2003；Stoboet al.2005；Suzukiet al.2003）。液相色譜-質譜聯用技術的發展和應用，極大地推動了對MERCENENE的精確定性和定量研究（Castberget al.2004；Quilliamet al.2001）。 ^[25-26] 

ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）是貝類毒素的重要測試方法之一。其方法原理是利用毒素誘發免疫反應產生抗體，利用抗體對抗原的特異性識別來測試各種毒素。酶聯免疫法具有靈敏、快速、簡單、易用以及適用現場分析等特點。MERCENENEs的酶聯免疫吸附方法和商品試劑盒正在研製中（Hesset al.2006）。 ^[23] 

蛤素由藻類產生，並釋放於海水中。在新西蘭，Mackenzie等（2004）利用主動吸附的原理，測試海水中脂溶性毒素的含量。具體操做方法為：把經過甲醇處理的吸附樹脂封裝於聚酯網袋內，然後吊掛於待測定海區的海水錶面以下，一定時間後取出，吸附劑中的毒素經提取、淨化和濃縮後用LC-MS/MS分析。該方法簡便經濟，可以連續監測海水中的毒素。 ^[27]