蛋白質純化技術

如酶的催化活性，就需要根據不同的蛋白質制定出相應的策略，採用不同的方法。電泳和色譜法是比較常用的方法，尤其是色譜法，對蛋白質的處理較為温和，又可大量製備有生物學活性的純化蛋白質，因此是目前最為廣泛應用的技術方法。

一、電泳：

在克隆基因表達產物的檢測分析過程中，電泳是常用的方法，但在純化蛋白時，通常都不採用電泳的方法。由於某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化蛋白質，常用下述方法進行：①從電泳後的凝膠上切下所需的相應條帶，將凝膠壓碎，用緩衝液浸泡，使其中的蛋白質擴散出來，從而獲得純化的蛋白質。此法簡單但回收率低。②將電泳後的凝膠用電洗脱的方法使蛋白質從凝膠轉移到溶液中，從而達到純化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的電泳裝置。

二、色譜法：

色譜法（chromatography）是蛋白純化中最常用的一種方法，這種方法既可以製備大量的純化蛋白質，又可以保持蛋白質的生物學活性。色譜的種類很多，可分為常規色譜和高效液相色譜（high-performance liquid chromatography,HPLC）。凝膠過濾色譜、離子交換色譜、親和色譜等均為常規色譜法。HPLC包括反相高效液相色譜（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）、離子交換高效液相色譜（ion exchange HPLC）等。根據目標蛋白性質的不同可選用相應的色譜分離技術純化蛋白質。

1.凝膠過濾色譜法

凝膠過濾色譜法（gel-filtration chromatography, GFC）又稱排阻色譜。凝膠是一類具有三維空間結構的多孔網狀顆粒物質，如瓊脂糖凝膠（sepharose）、葡聚糖凝膠（sephadex），將凝膠顆粒裝入色譜柱中即可用於物質的分離。當被分離物質通過凝膠柱時，大於凝膠孔徑的分子不能進入凝膠內部，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動和分配，流經的路途短，可很快被洗脱出來，而小於凝膠孔徑的分子則進入凝膠顆粒內部，在凝膠內部穿行，流經的路程長，移動的速度慢，最後被洗脱出來；分別收集不同時相的洗脱液，即可得到純化的物質。

GFC可能存在有多種離子、去污劑、尿素、鹽酸胍、高或低離子強度、常温或低温等多種條件下進行，根據所分離物質的性質不同可選擇相應的色譜條件，從而獲得有生物學活性的純化的生物大分子。

2.離子交換色譜法

離子交換色譜法（ion exchange chromatography,IEC）是根據物質的酸鹼度、極性和分子大小的不同進行分離的技術，通常包括吸附、吸收、擴散、穿透、靜電引力等複雜的物理化學過程。自然界的包括蛋白質在內的生物大分子都帶有電荷，當所需分離的物質通過離子交換色譜柱時，由於所帶電荷、分子量等不同，有些被固定相靠靜電引力所吸附，未被吸附的物質可被緩衝液首先洗脱出來；被吸附的物質由於所帶電荷多少不同，對固定相的親和力大小也不同，可被梯度離子緩衝液先後洗脱下來，使同一溶液中的不同物質被分離。色譜柱中填充的陰離子交換劑可用於帶正電荷物質的分離，而陽離子交換劑可用於帶負電荷物質的分離。

3.親和色譜法

許多生物大分子物質具有與其結構相對應的專一分子發生可逆性結合的特徵，如酶與底物及輔助因子、酶與抑制劑、抗原與抗體、激素與受體、核酸片段與其互補的核酸序列、生物素與親合素等，分子間的這種結合能力叫作親和力。

親和色譜（affinity chromatography）是利用生物大分子間所具有的特異性親和能力進行分離的方法。該方法常把可親和的一對分子中的一方固定在不溶於水的化合物上作為色譜的支持體即載體，使之固相化，作為固定相；另一方隨流動相流經固定相，雙方即可發生特異性結合；用流動相經過一段時間的洗滌，可將雜質去除，而後再利用親和吸附的可逆特性，改用特殊的流動相使所需分離的物質被解離下來，從而得到純化的物質。親和色譜法中的載體種類很多，最常用的是瓊脂糖凝膠（sepharose），其分子上有較多的羥基，活化後可與親和分子相耦聯，另外其理化性質穩定，不會影響色譜的分離過程。

親和色譜法可在温和條件下操作，純化過程簡單、快速、分辨率高，對分離含量極少且性質不穩定的生物活性物質極為有效。但由於不是任何生物大分子之間均有特異的親和力，而針對於某一種親和分子就需要製備專一的親和色譜柱，因此親和色譜的應用具有一定的侷限性，主要由於蛋白質尤其是酶、抗原、抗體的分離與純化。

蛋白質的一級、二級、三級和四級結構決定了它的物理、化學、生物化學、物理化學和生物學性質，綜述了不同蛋白質之間的性質存在差異或者改變條件是使之具有差異，利用一種同時多種性質差異，在兼顧收率和純度的情況下，選擇蛋白質提純的方法。

蛋白質在組織或細胞中一般都是以複雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有成千種不同的蛋白質。蛋白質的分離和提純工作是一項艱鉅而繁重的任務，到目前為止，還沒有一個單獨的或一套現成的方法能把任何一種蛋白質從複雜的混合物中提取出來，但對任何一種蛋白質都有可能選擇一套適當的分離提純程序來獲取高純度的製品。

蛋白質提純的總目標是設法增加製品純度或比活性，對純化的要求是以合理的效率、速度、收率和純度，將需要蛋白質從細胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來，同時仍保留有這種多肽的生物學活性和化學完整性。 ^[3]