蓖麻毒素

蓖麻毒素（約佔蓖麻蛋白的5%，分子量約為66kD）是一種Ⅱ型異二聚體核糖體失活蛋白，由核糖體失活酶（蓖麻毒素A鏈）及與半乳糖/N-乙酰半乳糖胺特異結合的凝集素（蓖麻毒素B鏈）組成，二者之間連接一個二硫鍵。對蓖麻毒素的一級結構進行分析發現，A鏈含有267個氨基酸殘基，分子量約為32kD，具有催化活性，是蓖麻毒素蛋白的效應鏈。A 鏈中N端第4位及C端附近分別含有1 個賴氨酸（Lys）殘基，是蓖麻毒素A鏈毒性作用的關鍵中心。B鏈具有兩個結構域，這兩個結構域具有同源性，由基因複製產生。結構域1中含有氨基末端，而結構域2中含有羧基末端。蓖麻毒素B鏈由267個氨基酸殘基組成，具有結合活性，是蓖麻毒素的結合鏈。 ^[2] 

蓖麻毒素的一、二級結構已清楚，由A、B兩條鏈組成。A鏈比B鏈稍短，兩鏈之間以一個二硫鍵相連接。它含有共價鍵結合的糖分子，糖的主要組成是甘露糖、葡萄糖和半乳糖。分子量為66,000。在0.1g分子半乳糖溶液中，毒素可在冰箱中貯存數月而不失活性，但煮沸易失去活性。

蓖麻毒素是從蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64000。毒素由A和B兩條多肽鏈組成，兩鏈間由一個二硫鍵連接。目前，A鏈和B鏈的氨基酸序列以及二級結構已基本清楚。毒素B鏈上含有兩個半乳糖或半乳糖殘基結合位點，可和細胞表面的含半乳糖殘基的受體結合，通過內陷作用進入細胞質，發揮毒性作用。蓖麻毒素A、B鏈上還分別含有1和2個糖支鏈，鏈末端均為甘露糖殘基，可以和網狀內皮細胞特別是巨噬細胞結合。後者細胞表面富含甘露糖受體，可優先攝取蓖麻毒素，這對於毒素髮揮生物功能有重要的作用。 ^[1] 

蓖麻毒素是一種細胞毒。當毒素進入體內，A、B鏈分開。A鏈通過滲透經細胞膜進入細胞漿，主要使真核細胞的核糖體抑制失活，從而抑制蛋白質的合成。B鏈與細胞表面結合，通過內陷作用轉入細胞內，它能促使A鏈進入胞漿。

蓖麻毒素對小鼠艾氏腹水瘤細胞、LD12白血病、B16黑痣瘤和列文斯肺癌細胞均有明顯的抑制作用，主要通過抑制蛋白質合成來殺傷癌細胞。另外發現它與其他藥物有增效作用如蓖麻毒素與亞德里亞黴素（adriamycin）伍用對殺傷白血病細胞有顯著的增效作用。 ^[3] 

小鼠靜脈注射LD₅₀值為2.7μg/kg，腹腔注射為7~10μg/kg；對狗LD₅₀值為0.6μg/kg；人致死量約為7mg。中毒後數小時出現症狀。早期有精神不振，噁心嘔吐，腹痛、腹瀉、便血；繼則出現脱水、血壓下降，休克嗜睡；嚴重者可出現抽搐、昏迷，牙關緊閉；最後因循環衰竭而死亡。少數病人可出現發燒、黃疸、便血、蛋白尿、無尿或血尿，終因酸中毒、尿毒症而死亡。該毒素易損傷肝、腎等實質器官，發生出血、變性、壞死病變。並能凝集和溶解紅細胞，抑制麻痹心血管和呼吸中樞，是致死的主要原因之一。

蓖麻毒素具有強烈的細胞毒性，屬於蛋白合成抑制劑或核糖體失活劑，這也是在構建免疫毒素時，應用到蓖麻毒素的主要原因。

合成的機理在20世紀70年代已經明確。首先，毒素依靠B鏈上的半乳糖結合位點與細胞表面含末端半乳糖殘基的受體結合，促進整個毒素分子以內陷方式進入細胞，形成細胞內囊，毒素從細胞內囊中進入細胞質，隨後蛋白鏈間二硫鍵被還原裂解，遊離出A鏈。A鏈是一種蛋白酶，作用於真核細胞核糖體60S大亞單位的28S rRNA，水解A4324位點的腺嘌呤N-糖甙甙鍵，使其脱去腺嘌呤，喪失抗RNA酶的抗性而被降解，不能與延長因子(EF-2)結合，從而干擾了核糖體，EF-2，鳥嘌呤三磷酸腺苷（GTP）複合體的形成，導致蛋白質合成的抑制，最終細胞死亡。已引起研究者注意的是：① B鏈對A鏈發揮毒性具有重要的促進作用。② 在細胞內鏈間二硫鍵的還原裂解對毒素髮揮毒性作用具有重要作用。③ 最新的研究表明：B鏈上的半乳糖結合位點也參與了毒素的體內毒性。 ^[3] 

蓖麻毒素誘導細胞因子的機理目前多數認為是通過刺激淋巴樣細胞產生的。主要為巨噬細胞和肝Kupffer′s細胞。這些細胞表面含有甘露糖受體，可與蓖麻毒素分子中3個末端甘露糖殘基特異結合而優先被攝取。蓖麻毒素誘導細胞因子的分泌有劑量和時間依賴性。毒素是否可誘導其他細胞因子的產生以及各細胞因子之間是否具有網絡免疫調節的作用，尚待探討。

1986年，Tracey等發現蓖麻毒素中毒大鼠的腸道損傷類似TNF/Chchectin處理的大鼠腸道。1991年Nadkami和Deshphude認為蓖麻毒素中毒後的許多現象，例如：發熱，肝出血性壞死，腹水，胸水的滲出，腸道的出血壞死性炎症等等早期的急性反應都與腫瘤壞死因子（TNF-α），白細胞介素（IL-1），IL-6的分泌有關。1993年，Licastro等檢測到蓖麻毒素誘導體外培養的外周血單核細胞分泌TNF-α和IL-1β，同時在蓖麻毒素中毒大鼠的血漿中亦可檢測到低水平的TNF-α。1994年Mudlooon等發現，體內注射抗TNF的抗體，將明顯降低蓖麻毒素對小鼠的氧化損傷。1997年，董巨瑩等亦報道了TNF在蓖麻毒素中毒小鼠肝臟的免疫組織化學定位。細胞因子參與機體損傷的另一個例子是：對於由蓖麻毒素構建的免疫毒素1，2期臨牀試驗中病人出現的副作用：包括髮熱、肌痛、毛細血管滲漏綜合症等可以通過封閉或拮抗這些細胞因子的功能而減輕。

蓖麻毒素的毒性具有明顯的劑量依賴性，毒素誘導細胞因子的產生，引起體內脂質過氧化損傷以及誘導靶細胞凋亡等等都是在小劑量範圍內具有的，而大劑量的蓖麻毒素仍主要表現為抑制蛋白質合成的毒性。毒素誘導細胞因子的產生及引起體內脂質過氧化損傷的作用，均與其糖鏈末端甘露糖殘基被巨噬細胞特異性攝取，並激活巨噬細胞有關，是毒素損傷的繼發作用。蓖麻毒素等蛋白質合成抑制劑誘導凋亡的理論研究對現有的凋亡理論可能會有重要的補充價值。 ^[3] 

蓖麻毒素與巨噬細胞的相互作用，不僅誘導細胞免疫，而且誘導產生自由基和活性氧，引起脂質過氧化作用。1991年，Muldoon和Stohes發現蓖麻毒素可以誘導小鼠體內的脂質過氧化作用，結果導致尿液中丙二醛、甲醛、丙酮的含量增加。1992年的研究表明，各臟器中脂質過氧化強度（MDA含量），還原型谷胱甘肽的減少以及DNA單鏈斷裂程度在毒素中毒36小時後最為強烈，且肝臟的損傷最為嚴重。結合以往的研究：谷胱甘肽的使用可以部分對抗致死劑量的毒素效應，具有潛在的化學保護作用，因此，Muldoon等認為蓖麻毒素引起的氧化作用可以歸屬到蓖麻毒素的毒性機理中去。

TNF-α抗體，鐵離子對蓖麻毒素誘導的脂質過氧化和氧化損傷起重要的調節作用。給小鼠注射抗TNF-α的抗體，可以明顯降低尿液丙二醛，甲醛，丙酮的含量。鐵離子以及去鐵敏（desferrioxamine）的摻入，可分別增加和減少蓖麻毒素誘導的脂質過氧化的水平。蓖麻毒素引起體內氧化損傷的機理還待更深入的探討。 ^[3] 

壞死和凋亡是細胞死亡的兩種方式。在引起細胞凋亡的三大類因素中，毒素，抗癌藥物是其中之一。以往認為化療藥物是通過引起靶細胞發生不可逆代謝障礙而殺死腫瘤細胞，近年來認為是通過改變生理環境而誘發細胞發生PCD而達到療效。

1989年，Leek等報道：在蓖麻毒素中毒的腸道病理研究中利用免疫組織化學和電子顯微鏡觀察到腸道上皮細胞的胞漿中存在凋亡樣的變化。1990年，Waring報道；蓖麻毒素可誘導巨噬細胞，未成熟T細胞出現DNA破碎，而後者被認為是與凋亡有關的生化改變之一。1991年，他們報道了蓖麻毒素誘導上皮樣細胞發生凋亡樣的形態學改變。1996年，報道了蓖麻毒素可誘導小鼠體內甲狀腺，脾臟的細胞出現凋亡現象。

蓖麻毒素等蛋白質合成抑制劑誘導細胞凋亡的機制與它們抑制蛋白合成作用無關，亦不需要Ca²⁺依賴性核酸內切酶的參與，而是與其升高細胞內的三磷酸肌醇水平有關。另外，有報道：巨噬細胞的粘附可以阻止蓖麻毒素誘導的巨噬細胞凋亡現象的發生。蓖麻毒素的抗吞噬細胞作用可能直接導致DNA斷裂和誘導細胞凋亡。資料表明：引起細胞壞死的有害因素在強度很大時可導致細胞壞死，但強度較小時卻引起細胞發生凋亡。蓖麻毒素誘導的細胞凋亡也存在明顯的劑量依賴性。總之，蓖麻毒素誘導細胞發生凋亡與傳統的蓖麻毒素作為蛋白質合成抑制劑並不構成矛盾。 ^[3] 

蓖麻毒素具有很強的毒性作用，毫克級的劑量即可致人或動物死亡。但截至目前，適用於人的解毒藥和特異性抗毒素特效藥尚未被研製出來。因此，建立快速有效的檢測方法成為國內外學者研究的熱點。根據蓖麻毒素的理化性質、生物化學特性及免疫學特性，建立了免疫吸收分析、生物傳感器分析及生物質譜分析等方法。 ^[4] 

免疫標記方法是將抗原或抗體進行生物學標記，利用蓖麻毒素抗原位點能與抗體發生特異性結合的特點而建立的檢測方法，是檢測蓖麻毒素最常用的技術手段。常用的免疫抗體標記方法有酶聯免疫吸附法、膠體金標記法及放射免疫法。利用自制的抗體（以羊為抗體制備動物製得）進行研究，結果表明，ELISA 方法可檢測到生物樣品中微克級的蓖麻毒素。通過進一步研究，建立了夾心ELISA方法，檢出限可達 2.5 ng/mL。

早期酶聯免疫吸附法主要採用多克隆抗體，可能存在一定程度上的交叉反應，影響檢測結果的精確性。而單克隆抗體是利用某一抗原表位為抗體，具有特異性較高的特點。因此，以單克隆抗體為基礎的蓖麻毒素檢測方法，是快速、靈敏、經濟、實用的定量檢測方法。劉文森利用膠體金技術標記所製備的單克隆抗體，進行檢測試劑條的製備。結果表明，隨着蓖麻毒素濃度的增加，膠體金試劑條的顏色逐漸減弱，試劑條的檢測靈敏度可達 10 μg/mL，滿足檢測需求。 ^[4] 

隨着生物標記技術的進一步發展，研究者成功建立了放射免疫檢測方法。該方法主要是利用抗原－抗體特異性結合而進行體外超微量蓖麻毒素檢測，具有高度靈敏性、精確性的特點。放射免疫方法可檢測出樣品中100pg數量級的蓖麻毒素，適用於對蓖麻毒素中毒者血液中蓖麻毒素含量的檢測。但該方法的缺點是操作處理比較繁瑣，對設備的要求比酶聯免疫法高，且對人員的專業性要求較高及放射元素的處理等條件限制了該方法的廣泛應用。 ^[4] 

高效液相色譜檢測將待測物質溶於流動相中，利用色譜柱固定相將流動相的組成進行分離，對檢測器收集到的峯信號轉換為待測物質濃度，進而來判定待測物質含量的一種方法，具有速度快、分辨率高、靈敏度高等特點。採用PROTEIN KW－802.5凝膠色譜柱，在柱温25℃、流速1mL/min、進樣量10μL的條件下進行蓖麻毒素檢測條件的建立。結果發現，蓖麻毒素在波長280nm條件下具有最大的吸收峯，出峯時間約為8.96min，在0.093～5.970μg具有良好的線性關係，最低檢測限達23.33ng。 ^[4] 

生物傳感器是將生物技術和電子技術聯合使用，將待測物與識別元件特異性結合後產生的生物敏感物質的化學信號轉變為電信號、光信號等，從而達到分析檢測目的。該方法無需特殊標記物，具有選擇性好、操作簡單、實時在線監測的特點，是醫學診斷、食品衞生檢驗等領域安全快速檢測的研究熱點。 ^[4] 

基質輔助激光解吸/電離（MALDI）及電噴霧等技術為分析極性強、難揮發等特點的生物樣品提供了可靠條件。肽質量指紋譜是利用特異性蛋白酶對不同蛋白質一級結構進行水解處理後得到具有獨特特徵的肽混合物，稱其為指紋譜。該方法是目前進行蛋白質鑑定的常用方法。將待測蛋白質樣品經垂直板電泳或二維電泳分離，經酶切、肽段提取後，將所得的肽段混合物進一步分離，通過電噴霧－質譜技術在線測定蛋白質的肽譜，從而實現鑑定。該方法不需要進行肽混合物的分離，具有操作簡單、分析快速及靈敏度高的特點。 ^[4]