腺苷酸環化酶

多肽、蛋白質類及兒茶酚胺激素如腎上腺素、胰高血糖素、胰島素、促腎上腺皮質素、促甲狀腺素等都是通過這一信息傳遞而發揮作用的。腺苷酸環化酶廣泛分佈於哺乳動物的細胞膜中，此酶催化ATP生成cAMP並釋放焦磷酸。

激素和相應的膜受體結合後，經G蛋白的中介激活腺苷酸環化酶。激素受體嵌在細胞膜的脂雙層內，它與激素結合的部位面向細胞外側。腺苷酸環化酶也居質膜中，位於細胞內側。

G蛋白位於細胞質膜胞漿面的一種外周蛋白，由3個亞基Gα、Gβ及Gγ，由於α亞基結構和作用不同，可分為激動型G蛋白和抑制型G蛋白兩類。

激動型 G蛋白（Gs）未被激活前，Gα蛋白與GDP結合，呈無活性狀態，一旦受體與激素結合後，即可誘發G蛋白上的Gα-GDP 與GTP交換，成為活性狀態的Gα-GTP 。同時，Gα-GTP即與Gβγ部分分離，並移動到鄰近的βγ腺苷酸環化酶部位，以激活腺苷酸環化酶，後者催化ATP變成cAMP。但Gα-GTP的壽命是短暫的，因為Gα本身具有GTP酶的活性，可以水解GTP為GDP與Pi。又成無活性的Gα-GDP，並返回與Gβγ結合成完整的無活性的G蛋白（a-βγ）-GDP。

第一類腺苷酸環化酶（AC-I）

第一類腺苷酸環化酶存在於大腸桿菌E. coli等許多細菌中（如CyaA P00936）。這是第一類被描述的腺苷酸環化酶。據觀察，缺乏葡萄糖的大腸桿菌產生cAMP作為一種內部信號，激活吸收和代謝其他糖的基因表達。cAMP通過結合轉錄因子CRP（也稱為CAP）發揮該作用。AC-I是一種大分子細胞質酶（約100kDa），具有大的調節結構域（約50kDa）用於間接檢測葡萄糖水平。截至2012年，AC-I沒有得到晶體結構，但已經獲得了一些間接的結構信息。已知其靠近N端的一半是催化部分，需要兩個Mg2+離子。S103、S113、D114、D116和W118是五個不可或缺的殘基。AC-I催化結構域與DNA聚合酶β的掌形結構域屬於同一超家族。 ^[1] 

第二類腺苷酸環化酶（AC-II）

這類腺苷酸環化酶是致病細菌（如炭疽芽孢桿菌Bacillus anthracis、百日咳桿菌Bordetellapertussis、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa和創傷弧菌Vibrio vulnificus）在感染過程中分泌的毒素，例如炭疽毒素。這些細菌還分泌蛋白質使AC-II進入宿主細胞，隨後外源腺苷酸環化酶破壞正常的細胞生理過程。AC-II的基因被稱為cyaA。AC-II酶已知幾種晶體結構。

第三類腺苷酸環化酶（AC-III）

由於第三類腺苷酸環化酶對人類健康的重要作用，它們被基於廣泛的研究並因此成為了我們最熟悉的一類腺苷酸環化酶。它們也存在於一些細菌中，特別是結核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis，它們似乎在結核桿菌的發病機制中起着關鍵作用。大多數AC-III是整合膜蛋白，參與將細胞外信號轉換為細胞內反應的過程。厄爾·薩瑟蘭（Earl Sutherland）發現了AC-III在人體肝臟中的關鍵作用——腎上腺素間接刺激腺苷酸環化酶在“戰或逃”反應(“fight orflight” response)中調動儲存的能量，並因此獲得了1971年的諾貝爾獎。腎上腺素的作用是通過G蛋白信號級聯，將化學信號從細胞外穿過膜傳遞到細胞內（細胞質）。外部信號（在本例中為腎上腺素）與受體結合，受體將信號傳遞到G蛋白，G蛋白將信號傳遞給腺苷酸環化酶，腺苷酸環酶通過將三磷酸腺苷轉化為AMP來傳遞信號。

cAMP是真核生物信號轉導中的一個重要分子，即所謂的第二信使。腺苷酸環化酶通常被G蛋白激活或抑制，G蛋白與膜受體偶聯，因此可以對激素或其他刺激做出反應。腺苷酸環化酶激活後，產生的cAMP作為第二信使，與蛋白激酶a和環核苷酸門控離子通道等其他蛋白相互作用並調節它們。

光激活的腺苷酸環化酶（PAC）是在纖細裸藻Euglena gracilis 中發現的，可以通過基因操縱在其他生物中表達。對含有PAC的細胞發射藍光會激活它，從而迅速提高ATP向cAMP的轉化率。這是神經科學研究的重要技術，因為它可以讓他們快速提高特定神經元的細胞內cAMP水平，並研究神經活動增加對生物體行為的影響。通過修飾視紫紅質鳥苷酰環化酶的核苷酸結合位點，研究人員最近設計出了一種綠光激活的視紫紅質腺苷酸環化酶（CaRhAC）。 ^[3] 

大多數AC-III是具有12個跨膜片段的跨膜蛋白。它先由6個跨膜段組成，然後是C1細胞質結構域，接着是另外6個膜段，最後是第二個細胞質結構域C2。其發揮功能的重要部分是N端以及C1和C2區域。C1a和C2a亞結構域是同源的，並形成分子內“二聚體”作為活性位點。在結核分枝桿菌和許多其他細菌中，AC-III多肽只有一半長，包括一個六次跨膜結構域，然後是細胞質結構域，但其中兩個形成功能性同二聚體，類似於具有兩個活性位點的哺乳動物AC-III結構。在非動物AC-III中，具有催化活性的胞質結構域與其他（不一定是跨膜）結構域相連。

第三類腺苷酸環化酶結構域可進一步分為四個亞家族，稱為IIIa至IIId類。動物的膜結合ACs屬於IIIa類。

反應發生需要兩個金屬輔因子（Mg或Mn）與C1上的兩個天冬氨酸殘基配位。它們對ATP的α-磷酸基上的核糖的3'-OH基團進行親核攻擊。C2上的兩個賴氨酸和天冬氨酸殘基選擇ATP而不是GTP作為底物，因此該酶不是鳥苷酸環化酶。C2上的一對精氨酸和天冬醯胺殘基負責穩定過渡狀態。然而，在許多蛋白質中，這些殘基發生突變而同時腺苷酸環化酶仍保持活性。

哺乳動物中有十種已知的腺苷酸環化酶亞型：ADCY1-ADCY10。（有時也有羅馬數字表示，主要不要與表示腺苷酸環化酶類型（如AC-III）的羅馬數字混淆。）其主要差異是於被調控方式，且在哺乳動物發育過程中在不同組織有差異地表達。

腺苷酸環化酶由G蛋白調節，G蛋白可以以單體形式或異三聚體形式存在，由三個亞基組成。腺嘌呤基環化酶活性由異三聚體G蛋白控制。當複合物由α、β和γ亞基組成且GDP與α亞基結合時，G蛋白表現為非活性或抑制性形式。為了激活G蛋白，配體必須與受體結合並引起構象變化。這種構象變化導致α亞基與複合物分離並與GTP結合。這種G-α-GTP複合物隨後與腺苷酸環化酶結合，並引起cAMP的激活和釋放。而關閉信號，即腺苷環化酶去激活和抑制cAMP的機制，GTP水解導致的活性Gα-GTP複合物的失活而快速完成的，該反應由位於α亞基的GTPase的固有酶活性催化。它也受毛喉素以及其他亞型特異性效應物的調節：

·同工酶I、III和VIII也受到Ca2+/鈣調素的刺激。

·Ca2+以鈣調素非依賴的方式抑制V和VI型同工酶。

·同工酶II、IV和IX受G蛋白的α亞基刺激。

同種型I、V和VI最明顯地受到Gi的抑制，而其他同種型則較少受到抑制性G蛋白的雙重調節。

·可溶性AC（sAC）不是跨膜形式，不受G蛋白或毛喉素的調節，而是作為碳酸氫鹽/pH傳感器。它錨定在細胞內的不同位置，並與磷酸二酯酶一起形成局部cAMP信號域。

在神經元中，鈣敏感的腺苷酸環化酶位於鈣離子通道旁，以加快對Ca2+內流的反應；它們可能在學習過程中起着重要作用，其證據之一是腺苷環化酶是重合檢測器(coincidence detectors)，這意味着它們僅由一起發生的幾個不同信號激活。在外周細胞和組織中，腺苷酸環化酶似乎以亞型特異性的方式與特定受體和其他信號蛋白形成分子複合物。

第四類腺苷酸環化酶（AC-IV）

AC-IV首次在嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila中發現，鼠疫耶爾森菌Yersiniapestis的AC-IV也同樣已經被報道。它們是最小的腺苷酸環化酶類；來自耶爾森氏菌的AC-IV（CyaB）是由19 kDa亞基組成的二聚體，沒有已知的調節成分。AC-IV與稱為CYTH（CyaB，硫胺素三磷酸酶）的馬馬利亞硫胺素三磷酸酶形成一個超家族。

第五、六類腺苷酸環化酶（AC-V IV）

這兩類形式的腺苷酸環化酶只在特定的細菌（例如瘤胃普雷沃氏菌Prevotella ruminicola和菜豆根瘤菌Rhizobium etli）中被報道，並且尚未被廣泛描述。VI類酶具有與III類酶相似的催化中心。

腺苷酸環化酶主要分佈於細胞質膜、核膜和內質網膜上。它也是一種磷酸酶，能催化ATP形成3'，5'－環磷酸腺苷（cAMP）並釋放出焦磷酸。

Howell等人（1972）首先用亞胺二磷酸腺苷（AMP－PNP）作底物，成功地對動物細胞中的腺苷酸環化酶進行了定位。現已確認，在未固定和固定的組織中，ATP－PNP是腺苷酸環化酶的專一性底物，在腺苷酸環化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，後者與捕捉鉛離子反應，生成一種不溶性的電子密度很高的產物。但鉛能在一定程度上抑制酶活性，為克服這一缺點， Fujiomto等（1981）設計了使用二鉀亞碸（DMSO）的硝酸鉛法。下面介紹的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸鉛法。

固定：配製固定液的緩衝液使用0.1M pH為7.4的二甲胂酸鈉緩衝液，內含8%蔗糖、5%的DMSO。

固定液配方： 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。對於肝臟來説，1%以上的戊二醛固定時，可導致明顯的酶失活。但若加5%的DMSO，酶活性能較好保存。總體來説，多聚甲醛與戊二醛的濃度應因組織而異。一般在0～4℃固定2小時或室温固定1小時。

洗滌：用配製固定液相同的緩衝液漂洗1小時～過夜，期間更換緩衝液數次；而後進行厚切片；

孵育：配方及條件見\ref{table:Enzyme-7},

作為腺苷酸環化酶特異底物的AMP－PNP在室温中或長期冷凍保存時，ATP、AMP－PN 和AMP－PNP－P等化合物容易增多，應引起注意。左旋咪唑的加入是由於底物AMP－PNP 容易受到組織的鹼性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制該酶的活性，在鹼性磷酸酶活性高的組織內，左旋咪唑的濃度等因素需特別注意考慮。氟化鈉為腺苷酸環化酶的激活劑，應根據組織不同進行前處理後，將氟化鈉加入到孵育液中。

後固定：後固定前，必須用不含DMSO的二甲胂酸鈉緩衝液進行充分洗滌。

殘存的DMSO可以與鋨酸反應，產生擴散性的微細顆粒。後固定用二甲胂酸鈉緩衝液配製的1%～2%的鋨酸。鋨酸後固定時對酶反應產物有一定的影響，有人認為固定時間不應超過10min，超過後可引起酶反應產物顆粒變粗變大、擴散，有時由於全部溶出而導致完全沒有反應產物的陰性結果。因此認為用鋨酸固定時間最好控制在5分鐘內。也有用2～4%的戊二醛代替鋨酸進行後固定。

對照實驗中可除去底物AMP－PNP，也可在對照實驗的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。

孵育液配方：& Tris－順丁烯二酸緩衝液（pH 7.4） 80mM

蔗糖 8%

氟化 20mM

茶鹼 2.0mM

AMP－PNP 0.5mM

硫酸鎂 4.0mM

左旋咪唑 2.5mM

DMSO 5%（V/V）

硝酸鉛 2.0mM

孵育條件： 孵育液pH 7.4

孵育温度 37℃