脂肪幹細胞

脂肪組織在人體內儲量豐富，通過抽脂從中獲得的大量脂肪幹細胞(ADSCs)，有自我更新增殖及多向分化潛能，可向脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞、成骨細胞、神經細胞、神經膠質細胞及胰島細胞分化，而且可分泌多種促血管生成因子和抗凋亡因子而抗炎、抗氧化，可抵抗氧自由基的損傷，有望成為修復受損的組織和器官的幹細胞來源。

1、脂肪幹細胞與間充質幹細胞( MSCs)的區別

研究發現，ADSCs與MSCs在多向分化潛能、表面標記等方面，沒有明顯的差別，ADSCs的表面標記與MSCs非常類似，如都有CD29、CD44、CD105、CD166、CD49e；而CD31、CD34、CD45、HLA-DR、CD133、c-Kit、Lin、CD11b均為陰性；差別在於ADSCs表達CD49d，不表達CD106；而MSCs則相反。

2、脂肪幹細胞分泌的細胞因子

ADSCs能分泌一定量的細胞因子，表達水平較高的細胞因子有肝細胞生長因子(HGF)、血管內皮生長因子( VEGF)、胎盤生長因子(PGF)、轉化生長因子-p( TGF-(3)；表達水平中等的細胞因子有成纖維細胞生長因子一2（FGF-2）、血管生成素-1(Ang-l)；表達水平較低的細胞因子有血管生成素-2（Ang-2）；有利於建立更好的損傷修復微環境。

3、脂肪幹細胞(ADSCs)在臨牀上的應用

幹細胞的臨牀應用價值主要表現在其組織修復與重建中。ADSCs能向各細胞系分化，包括中胚層源的骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞、神經細胞及胰島細胞。現在臨牀上主要的應用策略為轉基因定向誘導、再經體外擴增幹細胞後，移植入人體。 ^[1] 

脂肪幹細胞特點：1、自體幹細胞容易與自身細胞結合；2、有助於網狀成纖維細胞的增殖；3、可按要求誘導組織的生長及自體幹細胞的遷移。 ^[2] 

研究發現ADSCs細胞能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，同時它具有取材容易、少量組織即可獲取大量幹細胞，適宜大規模培養，對機體損傷小等優點，而且其來源廣泛，體內儲備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來新的研究熱點之一。

傳統的脂肪移植手段由於存在免疫排斥、炎症反應等缺陷難以得到讓人滿意的療效。據統計，自體脂肪組織移植到缺損部位後，通常其中40%~60%會被吸收。通過患者自身的脂肪組織內的幹細胞，來構建具有完整生物學結構和功能工程脂肪組織無疑將是解決這一難題的最佳方案。如何實現從幹細胞到脂肪細胞的分化，是構建工程脂肪組織不可迴避的問題。早在 2001 年，Zuk 等人發現脂肪幹細胞以來，就已經證明脂肪幹細胞具有向脂肪、軟骨、成骨、成肌等多向分化潛能。傳統的成脂誘導分化採用的方法多為混合誘導劑法。成脂誘導劑的不足是帶有毒性，對人體有較大危害。

除了以上通過誘導劑進行體外誘導分化外，用成熟體細胞與幹細胞共培養同樣可以使幹細胞定性誘導分化。2000 年， Maurin 等採用間接共培養的方式，研究脂肪細胞對成骨細胞擴增和活性的影響，並證明成熟脂肪細胞對人的成骨細胞的擴增有抑制作用;但對成骨基質細胞的擴增及活性，無顯着影響。2003 年Shigehisa 等採用三維膠原凝膠中共培養脂肪細胞和內皮細胞的方式研究二者間的相互作用，得出結論：內皮細胞參與到脂肪組織形成和擴增的過程當中。2007 年， Wang 等通過實驗證明，鼠來源脂肪幹細胞在膠原凝膠三維體系中，與OECs (Olfactory ensheathing cells-嗅鞘細胞)共培養過程中，能夠分化成為OECs-like(嗅鞘樣細胞)。

綜上所述，通過共培養方式體外誘導幹細胞定向分化已經成為研究熱點。因此，本研究嘗試採用trans-well 間接共培養方式，對人體吸脂來源的幹細胞與脂肪細胞進行共培養，並對比傳統成脂誘導劑法，考察共培養條件下幹細胞成脂分化的效果。

脂肪幹細胞來源於中胚層，現已證明其具有向骨、軟疾病種類臨牀階段骨、脂肪、肌腱、神經、內皮細胞、肝細胞和造血方向分化的潛能。例如，脂肪幹細胞治療心肌梗死的可能機制包括以下幾個方面：①向心肌細胞、血管內皮細胞分化，直接修復壞死心肌細胞。脂肪幹細胞能通過減少心臟重塑，增加血管生成來提高心肌梗死後心功能恢復。②內分泌功能，可以通過促進毛細血管以及小動脈的生長來減輕心肌梗死後心臟的損傷以及提高心功能恢復。③外源性保護因子的作用載體。脂肪幹細胞可能成為外源性基因在心肌梗死後心臟內表達的有效載體，對心功能的恢復有很大幫助。 ^[3] 

1.實驗儀器與材料

倒置熒光顯微鏡(IX71, Olympus);數字彩色攝像系統(Sony3CCD);圖像分析軟件(Image-pro-plus);離心機(Z23, Herm 德國);Transwell (3450-clear, corning, Costar 美國);純水機(Millipore-Q-Synthesis, Millipore Ltd.法國);六孔板(Corning Incorporated 3516, Costar 美國)。

DMEM 培養基(高糖，GIBCO 公司);胰酶(GIBCO 公司);乙二胺四乙酸鈉(上海試劑一廠);胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司);Ⅰ型膠原酶(Sigma 公司);油紅O(Sigma 公司);地塞米松(Sigma 公司);胰島素(Sigma 公司);吲哚美辛(Sigma 公司);異丁基甲基黃嘌呤(Sigma公司)。

2.脂肪細胞培養

將吸脂來源的脂肪組織用D-Hanks 沖洗，去除殘留的血細胞和組織碎片，把脂肪組織放入離心管中，記錄原始體積。向組織中加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，放入37℃氣浴振盪器中消化30 min。然後將消化好的組織靜置5 min，待其分層後，用吸管吸取位於懸液上層的脂肪細胞，將含有脂肪細胞的懸液以1000 r/min(167g)，離心2 min 後棄掉下層懸液得到脂肪細胞。

3.脂肪幹細胞的分離和培養

參照文獻，同上述脂肪細胞的分離一樣，將脂肪組織衝淨，稱重後消化。當消化完成後，棄掉上層未消化的脂肪組織，將下層的細胞懸液以1500 r/min(375g)，離心10 min 後棄上清，得到離心管底部的脂肪幹細胞團，將其重懸，密度調整到1×105mL-1，然後接種在培養面積為25 cm2 的細胞培養瓶中。

當幹細胞長滿培養瓶後按一傳二進行傳代，具體的傳代方法是：首先，用D-Hanks 沖洗一遍細胞，然後加入2 mL 的混合酶溶液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化，當在顯微鏡下觀察到細胞發生明顯的變形，縮成球狀後，立即用含有10%胎牛血清的培養基中止消化，並用吸管輕輕吹打瓶底部，確保細胞完全脱落分離到懸液中，再把細胞懸液置於離心機上，以1000 r/min (167g)，離心5 min。最後，將離心得到的細胞團重懸，調整密度為合適密度進行接種。

4.脂肪幹細胞和脂肪細胞的共培養

將準備好的脂肪幹細胞和脂肪細胞分別置於Transwell 的上室和下層中，脂肪幹細胞與脂肪細胞的個數之比分別為1:5，1:1，2:1 和5:1(4 組分別命名為A、B、C 和D 組)進行共培養，其中每孔中脂肪細胞的數量均為1×105 個。以上每組均做平行實驗(n=3)。

5.成脂誘導對照實驗

將幹細胞以1.5×105 每孔的密度接種在六孔板中，以正常培養基培養的樣本為成脂分化實驗陰性對照組，以成脂誘導培養基培養的樣本為陽性對照組。具體方法是：向基礎培養基(DMEM+10%胎牛血清)中加入1 μmol/L 的地塞米松、10 μmol/L 的胰島素、200 μmol/L 的吲哚美辛和0.5 mmol/L 的異丁基甲基黃嘌呤，配製成脂誘導培養基，每週換2 次液，直到進行成脂染色觀察為止，以上對照組均做平行實驗(n=3)。

6.油紅 O 和台盼藍複合染色

用 0.5%油紅O，對成脂誘導後的各組樣本進行染色。具體操作方法是：先用D-hanks將樣本細胞沖洗充分，然後加入油紅稀釋染色10~15 min，(油紅O 稀釋液配製方法:0.5%飽和油紅O 原液按3:2(油紅O:蒸餾水)加入蒸餾水，然後過濾，待用)，接下來用75%的乙醇溶液將樣本分化至間質清晰，然後蒸餾水衝，最後再用台盼藍對脂質以外的細胞核部分進行復染，並於100 倍鏡下觀察拍照。以每組樣本隨機選取5~10 視野進行拍照觀察以考察共培養方法的成脂誘導分化效果。

7.流式檢測

通過酶消化法將細胞收集到離心管中，細胞懸液調整密度為1×10⁵ mL-1，800r/min(120g)，離心5 min，棄掉上清，用4℃的冷D-Hanks 沖洗重懸細胞，再次將細胞懸液以800 r/min，離心5 min，之後棄去上清。然後用D-Hanks 將細胞重懸至1 mL，加入抗體5~10 μL，避光，冰上放置30 min。用D-Hanks 沖洗，離心，棄上清，重複該沖洗過程2~3次，確保將未結合抗體除淨最後，加入約200 至300 μL 的D-Hanks 製成懸液，用流式細胞儀檢測。

8.Hoechst/PI 死活染色

棄掉舊培養基，用D-Hanks 沖洗除去殘留培養基然後向每個Transwell 孔中加入質量濃度為1 mg/mL 的Hoechst 33342 大約10 μL，使其終質量濃度為10 μg/mL，37℃下避光反應10 min。待Hoechst 染色完成後，用D-Hanks 沖洗除淨殘餘的Hoechst 染料接下來，再加入用PI 染液，使其終質量濃度為10 μg/mL，4 ℃下避光反應15 min，染色完成也用D-Hanks衝淨殘餘染液最後，將染好的細胞置於倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

脂肪幹細胞與文獻中描述的相一致。均形態完整，生長狀態良好，適合進行共培養的後續研究。為成脂誘導陰性對照組，表明脂肪幹細胞不能自發生成脂質；在成脂誘導劑作用下，脂肪幹細胞能夠生成脂質，經統計約有20.3%的脂肪幹細胞發生了成脂分化。其中脂肪幹細胞與脂肪細胞之比分別為1:5，1:1，2:1 和5:1(其中每孔中的脂肪細胞數均為1×10⁵個)，儘管在不同比例下對脂肪幹細胞和脂肪細胞進行tranwell 間接共培養，然而經過8天共培養後，脂肪幹細胞並不能象成脂陽性對照組那樣產生脂質油滴。

此實驗結果的原因可能是由於共培養的持續時間過短所致。據文獻報導，成脂誘導分化的持續時間通常在1~2 周，即7~4d 左右。因此，有可能由於本實驗中脂肪細胞與脂肪幹細胞共培養時間過短，導致脂肪幹細胞與脂肪細胞沒能得到充分作用，所以不能實現成脂誘導分化。

基於上述分析，需延長共培養時間至20d，進一步考察共培養方式中幹細胞成脂分化的可行性。

為脂肪細胞與脂肪幹細胞經過20d 共培養後脂肪幹細胞的Hoechst/PI 死活染色結果。Hoechst 染料對活的細胞具有特異性染色的特點，PI 則對死細胞特異性染色。從中可以看到，兩組中的細胞均呈明亮的藍色，説明細胞的活性很好。基本上看不到PI 染成紅色的死細胞的存在。表明，本實驗中，經過共培養後的脂肪幹細胞，仍擁有良好的活性。

研究可以發現，共培養組a，d，g 3 組均未發生明顯的成脂分化現象。經過成脂誘導劑誘導的3 個不同接種密度的陽性對照組中均出現成脂分化，成脂分化後的細胞內出現大量密集在一起的小脂滴，當小脂滴達到一定數量後，就會聚合成為較大脂滴。這些成脂分化的現象與文獻中報道的脂肪幹細胞成脂分化的過程相一致。通過觀察c，f，i 3 組未加任何誘導劑，僅僅使用基礎培養基培養的脂肪幹細胞的陰性控制對照組，可以看到，脂肪幹細胞均勻生長於培養界面上，經過20d 的培養細胞的生長狀態良好，未發生明顯細胞破碎和衰退死亡的改變。

通過分析可以看到，不同脂肪幹細胞與脂肪細胞共培養比例下，共培養組B(共培養比例為1:1)和共培養組C(共培養比例為2:1)的流式結果，與相應的控制對照組B 和組C 相比，CD105 的表達發生下降(b,f,d,h)，CD105 表達分別是，共培養組B 為4.8%，對照組B 為12.4%；共培養組C 為1.3%，對照組C 為6.8%。而另外一個間充質細胞的特異性表面標記CD44，(a,c,e,g)，共培養組B 中為2.9%，對照組B 中為3.1%，沒有顯着變化；在另一共培養組C 中為0.9%，對照組C 中為5.4%，發生顯着變化。

通過以上分析發現(f,g)，經過共培養的脂肪幹細胞，其表面抗原CD105的表達發生明顯的降低，其結果接近不表達。CD105作為間充質細胞特異表達的表面抗原發生這一改變意味着，脂肪幹細胞在共培養過程中可能發生了一定程度上的分化。

採用人體吸脂來源的幹細胞與脂肪細胞進行共培養，8d 之內不能促使脂肪幹細胞成脂分化。且將共培養時間延長至20d 後，仍未能觀察到脂肪幹細胞發生明顯的成脂分化現象。通過流式細胞儀對共培養的脂肪幹細胞進行細胞表面抗原標記表達的分析，發現共培養後脂肪幹細胞與非共培養對照組相比較，其中間充質細胞特異性表達標記CD105 發生明顯降低，這就意味着本實驗的共培養過程中，脂肪幹細胞內部已發生一定程度的改變。

幹細胞是具有自我複製和多向分化潛能的原始細胞，是生命的起源細胞，是形成人體各種組織器官的原始細胞。幹細胞技術是生物治療的前沿技術，稱之為再生醫學。幹細胞是具有自我複製和多向分化的原始細胞，是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的原始細胞。

幹細胞是一類具有自我更新能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞或組織器官，醫學界稱其為“萬用細胞”。幹細胞是指尚未分化的細胞，存在於早期胚胎、胎盤及其附屬物、骨髓、外周血和成年組織中，它能夠被培養成肌肉、骨骼和神經等200多種人體細胞、組織和器官。幹細胞技術最顯著的作用就是：能再造一種全新的、正常的甚至更年輕的細胞、組織和器官。

關鍵詞：骨髓幹細胞 脂肪幹細胞 臍帶臍血幹細胞 種子細胞 幹細胞培養與分化 幹細胞移植幹細胞與中醫藥。

《β射線照射皮膚損傷創面注射骨髓間充質幹細胞後的創面癒合》

《利用人骨髓基質幹細胞構建組織工程心臟瓣膜的體外實驗》

技術與方法

《人臍血間充質幹細胞尾靜脈移植治療擴張型心肌病》

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學術探討

《碳納米管在生物醫學領域的應用現狀及展望》

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胚胎幹細胞，臍帶幹細胞，臍血幹細胞，羊膜幹細胞，羊水乾細胞，骨髓間充質幹細胞，造血幹細胞，腫瘤幹細胞，精原幹細胞，生殖幹細胞，成骨幹細胞，軟骨幹細胞，肌肉乾細胞，神經幹細胞，脂肪幹細胞，心臟幹細胞，氣管幹細胞，肝臟幹細胞，胰腺幹細胞，胃腸幹細胞，內皮幹細胞，角膜幹細胞，皮膚幹細胞，毛囊幹細胞，乳腺幹細胞，前列腺幹細胞，涎腺幹細胞等幹細胞相關基礎與臨牀研究成果，以及血液疾病的造血幹細胞移植相關問題。

研究內容：幹細胞研究的生物學特性、培養與分化、誘導技術、幹細胞與微環境、幹細胞與微小RNA調節、幹細胞因子及相關因子、幹細胞表型與鑑定、幹細胞移植與免疫耐受、細胞移植與基因表達、細胞編程與表觀遺傳、幹細胞保存與質量、幹細胞實驗動物模型等學術和技術的熱點問題。

幹細胞移植存在細胞來源少、免疫排斥反應和跨個體應用難等困擾。日前，一種解決上述問題的通用型幹細胞已由設想成為現實。第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所再生醫學課題組在中國工程院院士王正國指導下，成功將同種異體脂肪組織分離並“加工”獲得的低免疫源性種子細胞種植到組織工程骨仿生材料上，成功修復了約2.5釐米的大塊骨缺損，而臨牀表明超過1釐米的骨缺損無法靠自身修復來完成重建。相關論文發表在《科學》增刊上。

2005年，王正國提出研究通用型幹細胞的設想和目標。在張波研究員帶領下，課題組比較研究了胚胎、骨髓、脂肪等多種來源的幹細胞後，選定取材容易、創傷小和具有可控制的多向分化能力的脂肪組織作為解決幹細胞來源的突破口。課題組鎖定引起免疫排斥反應的關鍵因素——MHC（主要組織相容抗原複合體）。實驗證明，經過基因修飾、改建的脂肪幹細胞成功去除了免疫排斥反應，具有不致畸、不致瘤等生物安全性。

課題組先後用豬和恆河猴進行動物實驗，提取它們的脂肪幹細胞，轉入人鉅細胞病毒產物，下調MHC表達水平，使其成為通用型幹細胞。然後將其種植到課題組自行研製、具有完全自主知識產權的第二代仿生組織工程骨支架材料上，成功地修復了豬和恆河猴2.5釐米的大塊骨缺損。實驗證實，3個月後，移植的外源性基因逐漸丟失和降解，自體新生骨組織逐步取代移植組織。

該方法為臨牀製備大量“通用型種子細胞”提供了可能。預計在不久的將來，移植配型或將成為歷史。