肝素酶

肝素酶主要從一些利用肝素為碳源的細菌中分離得到，最初來源於肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum或Pedobacter heparinus）。此外，在許多微生物中也發現了肝素酶的存在，如棒桿菌（Corynebacterium sp.）、鞘胺醇桿菌（Sphingobacterium sp.）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）、解肝素擬桿菌（Prevotella heparinolytica）以及糞便擬桿菌（Bacteroides stercoris HJ-15）等。但至今肝素黃桿菌仍然是商品肝素酶的來源。已從肝素黃桿菌中分離純化出的肝素酶有三種，分別為肝素酶I、II、III，這三種酶的酶學特性各不相同。在肝素黃桿菌純化出的三種肝素酶中，只有肝素酶II的結構被解析，它的底物特異性也最差；肝素酶I則最適用於低分子量肝素的製備。

肝素酶具有許多重要的醫藥用途，主要用途如下：

（1）製備低分子和超低分子肝素

低分子量肝素和超低分子量肝素具有抗凝血功能，在抑制血管增生，阻止腫瘤轉移，治療癌症，抗過敏等方面也有特殊的功效。利用肝素酶生產低分子肝素條件比較温和，環境友好而且不會作用於硫酸基團，是理想的工業生產方法。

（2）體外循環血液中肝素的消除

某些重症病人例如尿毒症患者在手術過程中需要進行血液的體外循環，在體外循環的過程中為防止血液凝固需要加入肝素。為防止肝素殘存在血液中影響血液凝固，臨牀上需要加入魚精蛋白來中和肝素。臨牀研究發現魚精蛋白嚴重損害血小板，影響動脈血壓得穩定，而肝素酶沒有這種副作用，因此是理想的替代材料。需要注意的是，由於肝素酶對細胞外基質也有降解作用，因此用於血液肝素化去除的肝素酶也需進行固定化，並且要求肝素酶不能有免疫原性。

（3）肝素精確結構的確定

將待分析的肝素先用來自肝素黃桿菌的經過純化所得到的肝素酶進行降解，得到四糖產物，然後再用同樣來自肝素黃桿菌的經過純化所得到的乙酰肝素酶進行深層降解處理，通過對最終的產物分析，就可以推測出相應的肝素的結構。

（4）製備抗腫瘤藥物

由於肝素酶與腫瘤轉移密切相關，因而越來越受到重視。許多研究人員試圖尋找肝素酶的抑制劑，如硫酸海帶多糖等，抑制腫瘤的生長和轉移。

（5）抑制新血管生成及鹼性成纖維細胞生長因子介導血管內皮細胞的增殖

新血管的形成關係到組織的分化，傷口的癒合和腫瘤的轉移。大多數的研究者都把精力放在肝素類物質在新血管的形成過程中所起的作用。其實眾多的體外還是體內的新血管生成及鹼性成纖維細胞生長因子介導血管內皮細胞的增殖實驗表明，肝素酶I和III（不包括肝素酶II）可以有效地抑制它們的發生。其作用的機理可能是在過程中起重要作用的乙酰肝素的某一部分被肝素酶切除，使新血管的形成得到抑制。

（6）肝素酶在產科領域中的應用

胚泡植入需要子宮內膜細胞表面成分發生相應的變化。肝素酶能調節胚泡滋養層細胞，使其更易粘附和植入子宮內膜。同時，肝素的側鏈可結合多種活性因子:如表皮生長因子，血管內皮細胞生長因子，肝素結合的表皮生長樣因子及其他生長因子與細胞因子。肝素酶分解肝素側鏈後，這些因子釋放，可以促進滋養細胞分裂、增殖和血管生成。

胎盤組織是一種細胞滋養細胞侵入子宮內膜後形成的特殊結構，滋養細胞有很強的侵入能力。肝素酶通過分解肝素側鏈，釋放出細胞因子，促進滋養細胞侵入血管基底膜，使新生血管形成，為胚胎組織生長髮育奠定基礎。肝素酶與妊娠的成功和分娩的發動也有一定的關係。

目前，酶降解法中的肝素酶產品來源主要是肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum）中肝素酶I的分離純化。但此法所得到的肝素酶產量低、純化困難，造成酶的成本非常昂貴，也極大地限制了酶法制備低分子肝素的發展。而利用重組菌株生產肝素酶I是一條極有前景的途徑，但通常的表達體產生的肝素酶I容易形成包涵體，無法直接利用。

為開發高效的肝素酶生產技術，解決肝素酶應用的成本問題，清華大學化工系生物化工研究所聯合思清源生物科技有限公司研發人員從一株肝素黃桿菌中克隆得到肝素酶I的基因，利用融合蛋白技術，設計和構建了高效生產可溶性的肝素酶I的基因工程菌株，實現了可溶肝素酶I的生產，獲得了很高的酶活。研究表明，該重組可溶肝素酶I能和商品肝素酶一樣有效地降解肝素, 製備出理想的LMWH。通過控制酶解反應條件，可得到平均分子量在5000—6000的低分子量肝素寡糖。另外，利用膜生物反應器通過控制酶反應時間和酶量，還能夠製備出目前國際上備受關注超低分子量肝素（平均分子量2000-3000左右）。所以該融合表達法是一種具有廣泛應用前景的低成本生產肝素酶I的方法。該法得到的重組肝素酶I只需進行一步親和層析就能達到95%的純化效果；同時利用融合蛋白的親和吸附能力容易實現肝素酶I的定向固定化；融合酶的穩定性高，使酶的反覆使用成為可能，從而提高酶反應效率，降低酶的使用成本和低分子量肝素的生產成本。實驗結果表明，該融合酶搖瓶培養的酶活可以達到16000IU/L，5L發酵罐生產酶活達到了20000IU/L以上。同時，對多功能肝素酶的分子設計進行了系統的研究，得到了獲得高活性和高親和吸附融合酶的設計策略，而且也成功的用於肝素酶II和III的高效生產。由於採用了製備多功能酶的融合蛋白技術，該重組肝素酶I的生產、分離純化和使用成本可以大幅度降低，因此利用該融合蛋白生產具有理想平均分子量且分子量分佈範圍窄的低分子量肝素的方法藴含巨大的工業應用價值。 ^[1] 

^[2]  產品名稱： rHeparinase I (rHep I)

基因來源：肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum, ATCC 13125）

適用底物：肝素

形態：溶液

產品貨號及規格：RH-1107S 0.2IU / RH-1107M 0.5IU / RH-1107L 1IU

酶活：10000IU/L

分子量：84.4 KDa

適用pH值：最適7.4，適用範圍4-9

貯存温度：-20℃

適用温度：最適30℃，適用範圍20-37℃

酶活測定方法：232nm光吸收法，此法測定的1個國際單位（IU）是指在30℃，pH值為7.4的條件下能產生1 μmol 4，5-不飽和糖醛酸的效力。

肝素酶可選擇地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之間α（1-4）糖苷鍵，三種不同的肝素酶（酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ）具有非常不同的專屬性。肝素酶Ⅰ切斷肝素和硫酸乙酰肝素（相對活性約3:1）在葡萄糖胺和○-硫酸艾杜糖醛酸之間的連鍵，產物主要是二糖。此酶也能切斷肝素分子中的抗凝血酶Ⅲ結合五糖位點。

^[3]  產品名稱： rHeparinase Ⅱ (rHep Ⅱ)

基因來源：肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum, ATCC 13125）

適用底物：肝素和硫酸乙酰肝素

形態：溶液

產品貨號及規格：RH-2108S 0.2IU / RH-2108M 0.5IU / RH-2108L 1IU

酶活：4000IU/L

分子量：125.3 KDa

最適pH：最適7.6，適用範圍4-9

貯存温度：-20℃

最適温度：最適39℃，適用範圍20-37℃

酶活測定方法：232nm光吸收法，此法測定的1個國際單位（IU）是指在30℃，pH值為7.6的條件下能產生1 μmol 4，5-不飽和糖醛酸的效力。

肝素酶可選擇地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之間α（1-4）糖苷鍵，三種不同的肝素酶（酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ）具有非常不同的專屬性。肝素酶Ⅱ主要在己糖胺和糖醛酸（葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸）的1-4連接位點剪切硫酸肝素和肝素，相對活性大約2:1，剪切反應的主要產物是二糖。

^[4]  產品名稱： rHeparinase Ⅲ (rHep Ⅲ)

基因來源：肝素黃桿菌（Flavobacterium heparinum, ATCC 13125）

適用底物：肝素或硫酸乙酰肝素（首選）

形態：溶液

產品貨號及規格：RH-3109S 0.2IU / RH-3109M 0.5IU / RH-3109L 1IU

酶活：5000IU/L

分子量：116.3 KDa

最適pH：最適7.3，適用範圍4-9

貯存温度：-20℃

最適温度：最適45℃，適用範圍20-37℃

酶活測定方法：232nm光吸收法，此法測定的1個國際單位（IU）是指在30℃，pH值為7.3的條件下能產生1 μmol 4，5-不飽和糖醛酸的效力。

肝素酶可選擇地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之間α（1-4）糖苷鍵，三種不同的肝素酶（酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ）具有非常不同的專屬性。肝素酶Ⅲ在己糖胺和葡萄糖醛酸之間的1-4連接位點剪切硫酸肝素，主要產生二糖。該酶對肝素和低分子量肝素不起作用。