羥甲基胞嘧啶

數十年前就知道，哺乳動物DNA胞嘧啶鹼基有兩種修飾：5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。這些年來，5 mC得到廣泛的研究，作為一種重要的表遺傳修飾，參與基因表達調控、X-染色體失活、基因組印記、轉座子的長期沉默和癌症的發生，被稱為基因組第五鹼基；而5羥甲基胞嘧啶的存在，由於技術的限制，一直未能得到確認，近年來應用高精確的質譜分析，情況才得以改觀；同時還發現5羥甲基胞嘧啶的形成與惡性血液腫瘤相關，促進了這方面的研究，很快就其生物合成、功能、腫瘤臨牀應用研究和檢測技術等取得一系列重大進展，現作簡要評述。

1 生物學合成

近年來的一系列研究表明，TET（10-11易位 Ten-Eleven-Translocation)家族的氧合酶催化5mC向5hmC轉換，其生物學過程參見圖1。作為DNA組成的胞嘧啶，是在複製時由遊 胞嘧啶 5-甲基胞嘧啶 5-羥甲基胞嘧啶 （Cytosine C） (5-methylcytosine 5mC) (hydroxymethylcytosine 5hmC) 圖1 哺乳動物DNA胞嘧啶及其修飾的生物學過程（圖未能正確複製） 離胞嘧啶摻入，複製後通過DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases DNMT) 類的作用，利用腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine SAM)作為甲基供體，在胞嘧啶鹼基5位上添加甲基，從而形成5甲基胞嘧啶。進而在TET家族蛋白作用下，利用分子氧轉移羥基至5甲基胞嘧啶，形成5羥甲基胞嘧啶[1,4]。 由5甲基胞嘧啶合成5羥甲基胞嘧啶的關鍵分子是TET家族蛋白。在急性髓系白血病TET1基因是MLL基因易位的融合夥伴，它們分別定位於染色體10q24和11q23。TET蛋白是一種2-酮戊二酸（2 - oxoglutarate 2OG ） 和Fe（II）依賴性酶，研究證明它能在培養細胞和體外催化5甲基胞嘧啶轉換成5 羥甲基胞嘧啶。

5-羥甲基胞嘧啶存在於小鼠胚胎幹細胞基因組，用RNA干擾介導耗盡TET1後，5羥甲基胞嘧啶的水平下降；並認為，通過TET蛋白將5甲基胞嘧啶修飾成5羥甲基胞嘧啶後，應具有潛在的表遺傳調控作用[1，4]。

2 在基因組和不同組織中的分佈和功能

2.1 在哺乳動物基因組的分佈

哺乳動物基因組胞嘧啶甲基化標誌非隨機分佈的，可能與其功能相關。例如5甲基胞嘧啶參與基因表達調節，多位於基因調控區如啓動子等序列中的CpG二核苷酸中；而大部分5甲基胞嘧啶則位於轉座子，後者因組中的重複序列，可損害基因組的功能和穩定性，當各種類型的轉座子被密集甲基化後，其活性在所有類型細胞中被沉默[1]。由於5mC與5hmC高度相似，目前廣泛應用的、基於亞硫酸氫鹽的技術不能區分這兩種修飾，因此迫切需要開發特異性的、檢測5hmC的基因組技術，目前已取得一些進展，正在積累對hmC基因組分佈的新資料[5]。 1972年首先在成年鼠和蛙類的大腦報告了5羥甲基胞嘧啶的存在，約佔提取DNA中總胞嘧啶的~15%，後因未能被重複，此後30多年間一直未受到應有的關注。2009年新技術的應用，才開始積累了關於5羥甲基胞嘧啶在各種組織中分佈的、有價值的資料[1]。如有作者應用HPLC-MS和免疫組織化學的顯示，hmC是存在於所有組織和細胞類型，在中樞神經系統的神經細胞中有最高的濃度[5]。

最近應用新研製的5-hmC免疫學技術，確定5-hmC在人體組織中丰度，並比較在正常與癌性大腸癌組織間的5-hmC狀態。觀察到不同組織間的5-hmC含量有顯著差異。檢測到5-hmC佔總核苷酸比率高的是在腦、肝,腎和結腸癌組織(0.40-0.65%)，相對較低的是肺(0.18%)和極低的心臟、乳腺及胎盤(0.05-0.06%)。與正常大腸組織(0.46 - -0.57%)相比，大腸癌組織的5-hmC丰度顯著降低(0.02-0.06%)。上述結果首次顯示, 在人體組織中5-hmC分佈是組織依賴性的，其丰度在疾病狀態如大腸癌可被改變[6]。 另一組作者應用免疫組織化學檢測方法，研究5hmC在一大組鼠和人體組織中的分佈，發現大部分胚胎幹細胞和成體組織富含5hmC；在多層次、有序的組織中，5hmC的水平密切關係到細胞的分化狀態。最高水平的5hmC在終末分化細胞中觀察到，而在較少分化的組織幹細胞/祖細胞部分有很低5hmC水平；而且與正常組織比較，在多種癌組織5hmC水平顯著下降。結果顯示，5hmC在組織分化中發揮重要作用，並在癌症中5hmC大量丟失[7]。

參考資料 1．Dahl C. Grønbæk K. Guldberg P. Advances in DNA methylation: 5-hydroxymethylcytosine revisited. Clinica chimica acta.2011；412（11-12）：831-836. 2．Münzel M. Globisch D. Carell T. 5-Hydroxymethylcytosine, the Sixth Base of the Genome. Angew Chem Int Ed Engl. 2011; 50(29) :6460-6468. 3．Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 2009; 324(5929): 930-935. 4．Kim YH. Pierscianek D. Mittelbronn M. et al. TET2 promoter methylation in low-grade diffuse gliomas lacking IDH1/2 mutations. Journal of clinical pathology.2011; 64(10): 850-852. 5．Globisch D. Münzel M. Müller M. et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 2010; 5(12): e15367 6．Ndlovu MN. Denis H. Fuks F. Exposing the DNA methylome iceberg.Trends Biochem Sci. 資2011; 36(7): 381-387. 7. Haffner MC. Chaux A. Meeker AK. et al. Global 5-hydroxymethylcytosine content is significantly reduced in tissue stem/progenitor cell compartments and in human cancers. Oncotarget.2011; 2(8): 627-637.

江蘇省腫瘤防治研究所 遺傳學研究室 薛開先

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