纖連蛋白

纖連蛋白（fibronectin，FN）廣泛存在於動物界（從淡水海綿到人類），是一種大的纖維狀糖蛋白，含糖量4.5%~9.5%，其亞單位分子質量為220~250kDa，約由2500個氨基酸殘基構成。不同組織來源的FN亞單位結構不盡相同，但很相似。其肽鏈的共同特點是由一些重複的氨基酸序列構成若干球形結構域，每個球形結構域可分別與不同的大分子或細胞表面特異性受體結合，從而使之成為多功能分子。FN在體內的分佈十分廣泛：以可溶形式存在於血漿及各種體液中；以不溶形式存在於細胞外基質（包括某些基膜）及細胞表面。前者稱為血漿FN，後者稱為細胞FN。FN主要由間質細胞（如成纖維細胞、成軟骨細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞等）產生。 ^[1] 

纖連蛋白(fibronectin，Fn)是一種細胞外基質中的高分子量糖蛋白，主要以三種形式存在，即由肝細胞或內皮細胞生成的血漿纖連蛋白，由成纖維細胞、早期間充質細胞分泌合成的細胞纖連蛋白，以及胎盤、羊膜組織中的胎兒纖連蛋白。

纖連蛋白由兩個亞基通過C末端的二硫鍵交聯形成，每個亞基的分子量為220~250kDa，整個分子呈V型。纖連蛋白的每個亞基有數個結構域，它們由三種重複的模塊(modular structures)組成，其中包括：12個纖連蛋白I型重複位點(纖連蛋白I)，2個纖連蛋白II型重複位點(纖連蛋白II)，15-17個纖連蛋白III型重複位點(纖連蛋白III)，還有2個選擇性剪接位點(EIIIA和EIIIB)以及1個可變區(V)。以上各種模塊組成了纖連蛋白的功能性結構域，其中包括：N末端的70kDa結構域(纖連蛋白I1-9)；120kDa的中心結合結構域(central binding domain，CBD；纖連蛋白III1-12)，以及肝素結合結構域(heparin-binding domain，HepII；纖連蛋白III12-14)。兩個纖連蛋白III通過可變剪接生成ED(extradomain)A與B(血漿纖連蛋白沒有EDA和EDB，但細胞纖連蛋白含有數量可變的EDA或EDB)。在血漿纖連蛋白的二聚體中，只有一個亞基包含可變區V，而絕大多數的細胞纖連蛋白都含有可變區V。纖連蛋白通過纖連蛋白III10上的精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp，RGD)識別整合素異二聚體並與之結合，進而影響細胞黏附、遷移等。纖連蛋白分子也具有其他黏附位點，分別與膠原、纖維蛋白、肝素等結合，共同決定了細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的穩定性。

（1）血漿纖連蛋白　為可溶性的二聚體，由兩條肽鏈末端形成二硫鍵交聯組成，整個分子呈“V”形。FN參與凝血、創傷癒合、增強吞噬細胞功能等活動。正常人血漿中纖連蛋白的濃度約為0.3mg/mL，男人和老人的水平略高，婦女在行經期及妊娠後升高，分娩時達到高峯。暴發性肝損傷者血漿纖連蛋白急劇下降，某些癌症患者血漿纖連蛋白升高，腹水中的纖連蛋白濃度可協助鑑別腫瘤性腹水與非腫瘤性腹水（腫瘤性腹水中的纖連蛋白濃度顯著高於非腫瘤者，兩者相差10倍左右）。

（2）細胞表面纖連蛋白　為附着在細胞表面的不溶性寡聚體，在成纖維細胞表面呈纖維狀，與細胞內肌動蛋白絲的走行一致，二者在組裝上相互制約。例如，用細胞鬆弛素破壞肌動蛋白絲可導致纖連蛋白從細胞表面脱落。體外培養的細胞還常在橋粒或其附近發現纖連蛋白。當原始間質細胞分化為特定的細胞（如羊膜、牙胚及軟骨細胞）後，細胞表面的纖連蛋白常消失。可見，纖連蛋白在細胞表面的表達不僅與細胞的種類有關，而且與細胞的分化階段有關。在纖連蛋白研究史上曾引起廣泛關注的是，無論體外轉化的惡性細胞，還是體內生長的腫瘤細胞，細胞表面的纖連蛋白一般顯著減少，甚至完全消失，同時伴有細胞內的張力纖維減少。在培養液中加入來自正常細胞的纖連蛋白後，可使惡性細胞的表型正常化，即細胞內已減少的張力纖維又增多，細胞表面增多的微絨毛及膜皺襞減少，細胞從近球形變為多突、扁平的鋪展狀，細胞排列亦較規整，少重疊。然而，纖連蛋白並不能改變腫瘤細胞的惡性行為（如生長失控、侵襲、轉移等）。以上事實説明，細胞表面的纖連蛋白對細胞內骨架（微絲）的組裝具有組織作用，並有人將纖連蛋白稱為細胞外骨架。

（3）基質纖連蛋白　為高度難溶的纖維形多聚體，存在於細胞外基質中，包括細胞間質及某些基膜。纖連蛋白分子的多形性並非來自於不同的基因。肽鏈結構及亞單位組成不同的纖連蛋白，皆為同一基因的表達產物，該基因由70000個以上的核苷酸組成，約有50個外顯子。轉錄後的RNA前體以不同方式剪接，而產生不同的mRNA。此外，翻譯後的修飾（如糖基化）亦有差異。 ^[1] 

纖連蛋白廣泛參與細胞遷移、黏附、增殖、止血及組織修復等過程，調動單核吞噬細胞系統清除損傷組織處有害物質，具有生長因子作用。纖連蛋白作為細胞培養的基質，可提高多種細胞的貼壁率、匯合率，縮短細胞匯合時間，使細胞形態結構良好，代謝率增強，DNA、RNA及蛋白質合成速度顯著提高；細胞的集落率升高，原代培養成活率提高。將纖連蛋白塗到微球載體上作為細胞大量生產的介質，可以節省空間、原料，成為應用規模細胞培養技術生產新藥品的基礎物質。

細胞的黏附與遷移是細胞與細胞外基質進行特異性識別、結合與作用的結果。細胞外基質蛋白質分子與細胞膜相應的受體整合素之間的相互作用，是決定細胞黏附與遷移的重要機制。其中配體分子纖連蛋白與相應的整合素之間的相互作用，是細胞黏附與遷移調節的中心環節，FN可以將細胞連接到細胞外基質上。

纖連蛋白由3種類型的重複序列組成。這些重複序列組成不同的蛋白酶抗性位點結構，含有各種生物大分子的結合位點，如肝素、膠原、纖維蛋白和細胞表面受體等。纖連蛋白分子中含有至少兩種不同的細胞黏附位點區。如果纖連蛋白中的RGD序列（Arg-Gly-Asp）三肽結構區發生突變或缺失，則會導致纖連蛋白中心部位的細胞黏附活性下降。因此，纖連蛋白分子中的RGD結構位點是細胞黏附活動的重要結構基礎。除了RGD結構本身外，RGD附近的結構序列位點對於RGD正常構象的維持，都有重要功能。

纖連蛋白的表達在心血管系統的正常發育、正常生理機能的維持過程中具有重要作用，與心血管疾病的發生、發展有着極為密切的關係。

1）纖連蛋白與心臟發育：在胚胎發生過程中，纖連蛋白在不同組織中的表達具有高度的特異性。在心臟發育過程中，纖連蛋白mRNA的剪切加工受到嚴格的調控。在胚胎髮育早期EAⅢ和EBⅢ兩個外顯子的編碼區具有共同表達的特點，而胚胎形成和器官形成之後則有選擇地剪切去除，無論是纖連蛋白的總mRNA還是含有EAⅢ和EBⅢ外顯子的纖連蛋白在發育過程中都逐漸下降，至成年時，心臟中的纖連蛋白的總mRNA表達水平很低，而在衰老的心臟中繼續下降，纖連蛋白mRNA的選擇性剪切方式也發生相應變化。心臟中的纖連蛋白主要由心臟間質細胞合成分泌，在心肌細胞前體的移行和心臟的形態學發生中具有十分重要的作用。

2）纖連蛋白與心肌肥大：動脈高壓可引起心肌肥大、動脈壁肥大和血管周圍硬化，這一過程中膠原和纖連蛋白基因的表達水平顯著增高。對於高血壓引起的心肌肥大，含有外顯子EAⅢ的纖連蛋白mRNA的表達水平升高2倍以上，但含有EBⅢ外顯子的纖連蛋白mRNA的表達水平並沒有顯著的升高。在動脈高壓引起的心肌肥大的發展過程中，可見到局灶性心肌壞死，在發生壞死的病灶中，纖連蛋白mRNA的水平具有累積現象，並且此時所表達的纖連蛋白分子中又包含有EAⅢ和EBⅢ外顯子序列。心臟中的這種胎兒型纖連蛋白表達主要來源於冠狀動脈的平滑肌細胞以及主動脈的平滑肌細胞。成熟的血管平滑肌細胞又重新表達胎兒型的纖連蛋白，這在發生動脈粥樣硬化性疾病中也能見到。

結締組織的衰老有三個原因：間質細胞的衰老；細胞基質合成以後的衰老；細胞與基質之間相互作用的不斷變化。結締組織的這些變化，往往見於衰老的疾病過程中，而發生衰老相關的疾病時，這些結締組織的結構與功能將發生更為顯著的改變。

多數的間質細胞具有合成細胞外基質的功能，而且這些細胞處於旺盛的有絲分裂期。體外培養的動脈平滑肌細胞隨着衰老的發展，其合成細胞外基質的功能也逐漸下降。但與這些細胞的分裂活動沒有更為密切的關係。當處於有絲分裂狀態的間質細胞在三維膠原基質中進行培養時，其增殖效率顯著降低，體外培養其膠原合成速率的降低較其增殖功能衰退出現得早。但也有研究表明，體外培養的人皮膚成纖維細胞隨着細胞增殖率的下降，其膠原合成水平顯著上升。人皮膚成纖維細胞以及血管平滑肌細胞在體外培養過程中，纖連蛋白合成的水平也顯著升高。這充分説明細胞的增殖狀態與細胞外基質蛋白的生物合成調節是獨立進行的。關於彈性蛋白受體的研究表明，在富含細胞外基質的器官中，細胞所發生死亡的機制是一種細胞凋亡過程，其觸發因素是細胞內鈣離子濃度逐漸升高，失去其內環境穩定機制的調節，而不是其增殖潛能有何變化。基於這樣的考慮，從單一的細胞水平上是很難對結締組織的老化過程和特點進行研究的。

隨着結締組織的衰老，細胞外基質大分子衰老依賴性的變化也是顯而易見的。結締組織衰老依賴性的生物大分子的變化可以分為兩種情況，一個是細胞外基質蛋白質分子合成速率的變化以及細胞外基質蛋白質分子翻譯後的修飾加工的改變，生物合成以後的修飾加工過程包括逐步地與膠原纖維之間的交聯；另外一個顯著的變化就是彈性纖維中脂質和鈣的不斷累積。細胞外基質大分子的蛋白裂解降解過程也是細胞外基質生物合成以後的重要修飾方式。在纖維結締組織的衰老過程中，彈性蛋白酶型蛋白酶表達水平也顯著升高，這種彈性蛋白酶型的膜結合型的平滑肌絲氨酸蛋白酶，也可以是皮膚成纖維細胞的金屬內肽酶。這種酶的表達水平和活性可以作為結締組織衰老程度定量測定的一個指標。

研究腫瘤轉移的方法有多種，一種是靜脈注射腫瘤細胞，然後測定轉移瘤灶的數目及直徑。靜脈注射腫瘤細胞懸液時，瘤灶一般在肺或肝中發生。但這樣忽略了腫瘤細胞從瘤組織中剝離，浸入血管等腫瘤轉移的早期過程，而只是重複了血液系統腫瘤發生轉移的最初步驟。另一種為自發性轉移模型。在腫瘤研究中鑑定了一系列的具有高度轉移特性的腫瘤和腫瘤細胞，當移植給受體動物之後可形成瘤灶，併發生轉移，此時可通過定量發生轉移的瘤灶數目及直徑，對其轉移的潛能進行測定。

根據纖連蛋白的一級結構序列，設計併合成含有RGD的序列GRGDS，研究這一多肽對於B16-F10小鼠黑色素瘤細胞在C57BL/6純系小鼠的肺臟中形成轉移瘤灶能力的影響。GRGDS多肽其血液循環中的半衰期為8分鐘，可以特異性地抑制B16-F10黑色素瘤細胞在純系小鼠肺臟中的瘤灶形成能力，而且這種抑制作用的效果是GRGDS多肽劑量依賴性的。GRGDS多肽的主要作用似乎是阻斷腫瘤細胞在肺臟中的附着，而對於處於血液循環中的黑色素瘤細胞團的大小以及在肺臟中形成的瘤灶的直徑沒有顯著影響。GRGDS多肽阻斷黑色素瘤肺轉移的能力，與動物缺乏血小板的正常功能以及自然殺傷細胞的功能狀態無關。因此，認為多肽抑制腫瘤轉移的機制可能是破壞了腫瘤細胞早期黏附的一些步驟。即使使用單一劑量的合成多肽GRGDS，也可以顯著破壞黑色素瘤細胞的轉移，並提高荷瘤小鼠的平均壽命。 ^[1] 

在創傷初期的凝血階段，纖連蛋白從血小板中釋放出來，通過與血漿轉谷酰胺酶與纖維蛋白交聯，發揮黏附、趨化、調理和吞噬作用。纖連蛋白激活中性粒細胞，增強其黏附力，加速其向創區聚集。在創傷修復中期，纖連蛋白是成纖維細胞的重要趨化因子。當纖連蛋白與纖維蛋白交聯後黏附於血凝塊上，有助於成纖維細胞在其上的移動，並迅速進入傷區。進入傷區的成纖維細胞可大量分泌纖連蛋白，並與Ⅲ型膠原共同沉積在細胞間質中。在肉芽組織形成並逐漸成熟的過程中，成纖維細胞和角質細胞對纖連蛋白包裹的膠原或組織碎片有吞噬作用。在傷口邊緣和肉芽組織中都有纖連蛋白附着的成纖維細胞。纖連蛋白作為一種具有重要生物學功能的基質因子，在創傷修復的各個階段發揮了重要作用。

纖連蛋白作為細胞外基質，與喉癌、膀胱癌及胃癌等的發生、發展及預後有密切關係。喉鱗狀細胞癌組織間質的變化主要受間質纖連蛋白的影響。纖連蛋白、ColⅠ和Col Ⅳ的檢測對於預測頸淋巴結轉移情況、確定選擇性頸清掃術的時機、確定原發灶的手術範圍，以及估計患者預後均有一定意義。尿纖連蛋白和尿纖連蛋白/CR可作為膀胱癌患者預後評估的有效指標。基底膜纖連蛋白及間質纖連蛋白改變的程度與腫瘤的發展及惡性程度密切相關，因而胃癌組織內纖連蛋白表達的改變可作為判斷預後的指標之一，更為纖連蛋白作為腫瘤治療的新目標提供了理論依據。

作為細胞外基質蛋白，胎兒纖連蛋白(fetal fibronectin，FFN)介導胎膜與子宮蜕膜間的相互作用。在孕早期，FFN出現於宮頸陰道分泌物中，但孕20周後，FFN陽性提示胎盤與子宮蜕膜的黏附受到破壞。