凝膠等電點聚焦

近年來，等電點聚焦電泳又有了新的進展，可以分辨等電點只差0.001pH單位的生物分子。由於它的分辨力高、重複性好、樣品容量大、操作簡便、迅速，在生物化學、分類學、分子生物學及臨牀醫學研究等諸方面，都得到廣泛應用。

等電點聚焦電泳產生pH梯度的方法有兩種：一是用兩種不同的pH緩衝液相互擴散，在混合區形成pH梯度，此為人工pH梯度。這種pH梯度不穩定，常用於製備電泳；另一種是利用載體兩性電解質在電場作用下形成自然pH梯度。本實驗就是利用載體兩性電解質形成的自然pH梯度進行蛋白質樣品等電焦聚電泳的。

理想的載體兩性電解質應該在其本身的等電點處有足夠的緩衝能力和良好的導電性，且分子量要小，組成與被分析樣品有所區別，對分析樣品無變性作用或發生化學反應。

R1和R2為氫或帶有氨基的脂肪基。這一反應的特點是生成眾多的異構物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。混合物中各成分的含量、等電點的分佈，取決於原材料的性質、比例和合成條件。常用的載體兩性電解質的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Pharmacia公司）、Serralyty（Serva公司），近來已有國產商品了。不同廠家合成的方法不同，電泳的條件也略有不同。載體兩性電解質商品在使用時還存在一些問題，如樣品中的鹽濃度對pH梯度有影響等，但畢竟優點很多，仍然得到廣泛應用。

它們在酸性條件下帶正電荷，在鹼性條件下帶負電荷。當它們所帶的正負電荷相等時，其淨電荷為零，呈電中性，此時溶液的pH值為該兩性電解質的等電點，以pI表示。所以兩性電解質的等電點在數值上等於它呈電中性時溶液的pH值。等電點是反映兩性電解質在溶液中得失質子的能力，是它的物化性質。兩性電解質在溶液中的行為可以從兩方面看，一方面溶液的pH決定它帶電荷的性質。如溶液是pH7，對pI=9的兩性電解質來説，是處於酸性環境，故帶正電荷；但對pI=3的兩性電解質來説，卻是處於鹼性環境，故而帶負電荷。所以，不同pI的兩性電解質，在同一環境中帶有不同性質和數量的電荷；另一方面，溶液中的兩性電解質又破壞了水的解離平衡：

使溶液pH有所改變。當某一兩性電解質pI較低，即釋放質子（H+）能力較強，使溶液pH值下降，這類兩性電解質稱為酸性兩性電解質；反之，pI高的可使溶液pH值上升，稱為鹼性兩性電解質。所以，在溶液中的兩性電解質一方面受溶液pH值的影響，決定其帶電的性質；另一方面，它又影響周圍環境（水溶液），使其pH值有所改變。

載體兩性電解質是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI其分佈在2.5—10之間。在製備聚丙烯酰胺凝膠時，將其混溶其中。電泳時凝膠板正極的電極液是磷酸，負極是氫氧化鈉。正極是酸性環境，載體兩性電解質都帶正電荷，但由於pI的不同，其所帶正電荷數量就有所差異電泳時負極泳動的速度也就因此不同。同理，負極是鹼性環境，載體兩性電解質帶有數量不等的負電荷，以不同速度向正極泳動。根據兩性電解質的特性，在泳動過程中又不斷地與溶液交換質子，改變了溶液的pH。當達到平衡時，即得失質子相等，不再出現質子的交換時，載體兩性電解質到達等電點並各處於自己的pI區域，pI即是指溶液的pH值，所以，溶液也因此呈現不同的pH，隨載體兩性電解質的pI梯度而形成pH梯度。由於凝膠的防對流擴散作用，使pH梯度保持穩定不變。實驗操作中，要求開始電泳時恆壓60V，15min，目的在於使小分子的，泳動快的載體兩性電解質可在短時間內形成一個粗略的pH梯度。此後，恆流為8mA，是為了避免電泳開始時介質中帶電顆粒較多，電泳電流過高而破壞凝膠。當各種蛋白質逐漸泳動到各自等電點位置時，帶電顆粒逐漸減少，出現電阻增大，電壓隨之增高現象。當電壓升到550V時，帶電顆粒已大為減少，電流不再偏高，故恆壓到580V，繼續電泳120min後，蛋白質顆粒慢慢地集中到它等電點位置。電流接近於零時，蛋白質顆粒不再泳動，電泳也到此結束。蛋白質樣品也因其等電點的差異而得到集中和彼此分開。