破壞性試驗

通過對降解產物的測定，驗證檢測方法的可行性，分析藥物可能的降解途徑和降解機制。

每項破壞性試驗通常包括以下內容：酸降解一般採用0.1mol/L－1mol/L鹽酸或硫酸；鹼降解採用0.1mol/L－1mol/L的氫氧化鈉溶液；氧化降解採用合適的過氧化氫溶液。以上三種試驗，為了加快反應或者提高降解強度，必要時可以加熱或提高濃度；高温試驗通常温度高於加速試驗温度的10℃，如50℃、60℃等，對於原料藥有時需考慮水溶液或混懸液的降解，或者考慮在不同的pH值條件下的降解；光照試驗條件可採用4500LX。破壞性試驗的具體條件，與具體藥物密切相關，需結合具體藥物的特點，選擇合適的條件，使藥物有一定量的降解，並對可能的降解途徑和降解機制進行分析，保證實驗的意義。

藥物經強力破壞產生的降解產物通常採用色譜法測定，需結合藥物和可能降解產物的理化性質，選擇不同的色譜方法（HPLC、GC、TLC）或檢測器，有時可採用不同分離機理的色譜系統。下面以HPLC法分析降解產物為例，説明在進行破壞性試驗時的關注點和存在的問題：

問題和關鍵

1、在選定的破壞條件下，藥物應有一定量的降解。

雖然不是每一種破壞性條件都使藥物產生降解產物，但一般情況下，很少有一種化合物對每一種破壞性試驗條件都穩定，因此，可以通過試驗，選擇合適的條件，如提高酸、鹼、氧化的濃度或者通過加熱等，使藥物降解。

對於採用HPLC法測定降解產物時，以主成分計算，一般降解10%左右。應採用有效的方法對降解產物進行檢測，關注測定的回收量，通常應達到90%左右，證明檢測方法的有效性。

對於破壞性試驗時降解量較大的降解產物，建議結合穩定性研究中加速試驗和長期試驗的具體雜質數據，參考ICH對新原料藥中雜質的規定（每日服用最大劑量不超過2克時，鑑定閾值為0.10%；每日服用最大劑量超過2克時，鑑定閾值為0.05%。），必要時進行定性分析，並作為已知雜質，根據安全性數據，採用已知雜質對照，確定合理的限度，訂入質量標準。不能採用已知雜質進行對照時，可通過測定降解產物、主成分在測定波長處的吸收係數，分析兩者的差異。若兩者吸收係數相差較大時，建議採用響應因子校正後進行有效控制；如果兩者吸收係數相差較小，建議採用自身對照法或峯面積歸一化法進行有效控制。

藥物進行破壞性試驗時通常降解為小分子物質，但也有發生聚合，形成聚合物，如β－內酰胺類抗菌藥物，在高温或高濕時有可能產生聚合物，故應採取有效方法進行檢測。

在這方面存在的主要問題是：（1）主藥完全降解，無法對降解產物進行有效檢測；（2）由於選擇的降解條件強度不夠，使藥物未能降解，而誤認為藥物穩定；（3）不能選擇合適測定方法，測定降解產物，使主成分降解後測定的回收量偏低；（4）未考慮破壞性試驗時產生的聚合物；（5）選擇的色譜流動相不合適，在圖譜中有干擾峯。

2、分離度與峯純度分析

破壞性試驗產生的降解產物的個數比較多，採用HPLC法測定時，需考慮主成分與降解產物之間、降解產物相互之間的分離度，保證降解產物峯與主峯、降解產物峯之間有良好的分離度。另外，對於原料藥，分離度符合要求也應考慮到主藥與起始原料、各合成中間體是否有良好的分離度；對於製劑，應注意輔料、輔料降解產物的干擾。色譜條件的確定通常以最難分離的兩個降解產物或降解產物與主成分之間的分離度符合要求作為依據之一。鑑於降解產物檢測時對分離度要求高，故推薦色譜分析時採用梯度洗脱，以有效分離降解產物。

與分離度密切相關的是峯純度分析。檢測峯純度通常採用二級管陣列檢測器或者液質連用技術分析測定各色譜峯的純度，説明在主峯中、各降解產物峯中有沒有包含其它峯。簡單地通過觀察峯形判斷峯的純度沒有説服力。對於創新藥物的破壞性試驗來説，峯純度分析非常重要，一是可以瞭解降解產物的特性；二是可以有效地檢出和控制雜質。存在的主要問題是：（1）主峯上出現明顯的降解產物峯，測定方法不可行；（2）未對峯純度進行有效分析，這是一種常見現象，在此情況下無法判斷主峯中是否包含着降解產物峯；（3）對於製劑，未考慮輔料降解對測定結果的干擾。

3、檢測靈敏度的考慮

對破壞性試驗產生的降解產物，通常考慮採取改變測定波長，來分析和檢測降解產物峯個數和含量，確定合理的檢測條件和方法。這也是測定波長確定的重要依據之一。必要時可採用不同機理的色譜系統檢測降解產物。原則上講，所選擇的雜質檢測方法應能測定破壞性試驗中藥物的每個降解產物（而且也考慮到起始原料、每個合成中間體的檢出），從而達到對降解產物的控制，同時只有這樣，才能保證有合適的回收量。目前在審評中發現存在的主要問題是僅提供主成分的檢測限，以主成分的檢測限作為測定波長確定的依據，而忽視對部分降解產物（包括起始原料和中間體）的檢出，最終體現在降解的回收量達不到一定的要求，僅有藥物降解，沒有降解產物檢出。

充分認識破壞性試驗在雜質檢測方法建立中的重要意義，建立科學合理的雜質檢測方法，對於保證臨牀用藥安全起着重要作用。

強制降解試驗是指將原料藥或製劑置於比較劇烈的試驗條件下，考察其穩定性的一系列試驗。一般而言，該試驗的目的主要有以下兩方面：一是通過考察藥品在一系列劇烈條件下的穩定性，瞭解該藥品內在的穩定特性及其降解途徑與降解產物。例如，通過高温降解試驗，可以瞭解所考察的藥品在高温條件下是否穩定；如果不穩定，大致在何種條件下不穩定，該藥品又是通過何種降解途徑得到何種降解產物。其二，這些試驗也能在一定程度上對有關物質分析方法用於檢查降解產物的專屬性進行驗證。

對於創新藥，由於對其各方面的性質均不夠了解，因此，通過設計比較完整的強制降解試驗，可以比較全面地瞭解其穩定特性，從而為製劑處方、工藝的設計，以及產品儲存條件的確定等提供有益的參考。所以對於創新藥而言，通過強制降解試驗來了解藥物的穩定特性就顯得尤為重要。對於仿製藥而言，如果已有充分的文獻資料對該藥物的穩定特性及其降解途徑與降解產物進行比較全面的闡述，則沒有必要再通過強制降解試驗來重複瞭解這些背景知識。此時，強制降解試驗的目的主要就是為了驗證降解產物分析方法的專屬性。並且，由於國內在進行有關物質研究時，一般不對各有關物質進行定性研究，也無相應的雜質對照品，所以在對有關物質的分析方法進行驗證時，很難用雜質對照品對方法的專屬性、檢測限等進行驗證。故作為對有關物質分析方法驗證的一種補充，國內在制定相關指導原則時，要求對原料藥及製劑進行必要的強制降解試驗，以考察分析方法的可靠性。

根據強制降解試驗的目的，該項試驗一般應考察藥品在酸、鹼、高温、強光、氧化等因素影響下的穩定性。對固體狀態的原料藥而言，一般還需分別考察該原料藥在固體和溶液狀態下的穩定性。另外，為全面瞭解該藥品的穩定特性及其降解途徑，還可根據情況進行以上因素綜合存在時的強制降解試驗，例如，可以考察樣品溶液分別在中性、酸性或鹼性條件下對高温或強光的穩定性等。

在設計各項目的具體試驗條件時，應結合該藥的劑型、工藝條件等進行綜合考慮，只要達到了強制降解試驗的目的，所選的試驗條件就是合理的。由於各藥品的化學結構、劑型、工藝條件等各有不同，很難提出一個統一的試驗條件，下面所介紹的各降解試驗的條件僅供大家在研究中參考：

1．酸降解試驗

一般選擇0.1N的鹽酸，在室温或加熱條件下進行考察。酸液的濃度、考察的温度與時間均可根據具體品種，在前期預試驗的基礎上靈活確定。

2．鹼降解試驗

一般選擇0.1N的氫氧化鈉溶液，在室温或加熱條件下進行考察。鹼液的濃度、考察的温度與時間均可根據具體品種，在前期預試驗的基礎上靈活確定。

3．高温降解試驗

可分別在固體和溶液狀態下進行考察，具體的考察温度與時間均可根據具體品種，在前期預試驗的基礎上靈活確定。例如，可分別在60、80℃考察30天，或在130℃考察8小時。

4．光降解試驗

可分別在固體和溶液狀態下進行考察，具體的光強度與考察時間可根據具體品種，在前期試驗的基礎上靈活確定。例如，可按照ICH的Q1B指導原則進行2個循環的考察：先經一百二十萬勒克斯（Lx）×小時的冷白熒光燈照射，再經200瓦小時/平方米的紫外熒光燈照射。

5．氧化降解試驗

主要在溶液狀態下進行考察，氧化劑可採用飽和的氧氣或不同濃度的雙氧水，分別在室温或加熱條件下進行考察。

在以上試驗結束後，應根據試驗的目的與結果，總結得出明確的結論：藥品在各種條件下的穩定特性、降解途徑與降解產物，有關物質分析方法是否可用於檢查降解產物等。