皮膚幹細胞

表皮幹細胞是各種表皮細胞的祖細胞,來源於胚胎的外胚層,具有雙向分化的能力。一方面可向下遷移分化為表皮基底層,進而生成毛囊；另一方面則可向上遷移,並最終分化為各種表皮細胞。 ^[1] 

表皮幹細胞在胎兒時期主要集中於初級表皮嵴,至成人時呈片狀分佈在表皮基底層。表皮幹細胞在組織結構中位置相對穩定,一般是位於毛囊隆突部皮脂腺開口處與豎毛肌毛囊附着處之間的毛囊外根鞘。

一般認為表皮幹細胞在表皮基底層呈片狀分佈，而在沒有毛髮的部位如手掌、腳掌，則僅存在於基底層與真皮乳頭頂部相連處。其中有1%～10%的基底細胞為幹細胞。隨着年齡的增大，表皮腳(伸向真皮層內的表皮基底層)與真皮乳頭逐漸平坦，表皮於細胞的數量也隨之減少。這也是成人的創傷癒合能力較小兒弱的重要原因之一。 ^[1] 

不同發育階段的人皮膚表皮幹細胞的含量不同。胎兒期表皮基底層增殖細胞均為表皮幹細胞和短暫擴增細胞，而少兒表皮基底層中部分細胞為表皮幹細胞和暫時擴增細胞，成人表皮幹細胞和暫時擴增細胞所佔比例則進一步降低。

皮膚幹細胞具有強大的自我更新能力，在體外培養時呈克隆性生長。通常情況下，皮膚幹細胞通過不對稱分裂產生一個子代幹細胞和一個定向祖細胞即短暫增殖細胞。子代幹細胞具有高度的增殖潛能，但分化較慢。短暫增殖細胞增殖潛能有限，但可不斷增加分化細胞數量，產生終末分化細胞。表皮幹細胞及其產生的短暫增殖細胞、終末分化細胞構成一個表皮增殖單位，分佈在表皮不同的空間。表皮更新時，由基底層表皮幹細胞分化產生的短暫增殖細胞失去對基底膜的黏附，向上遷移，最後經過一系列生物化學和形態學變化，達到表皮最外層，形成角質化表皮細胞，角質化表皮細胞最終脱落為皮屑。表皮受到外來損傷時，還可通過對稱分裂產生兩個幹細胞或兩個祖細胞，增加幹細胞或分化細胞的數量，從而更好地適應機體的需要。 ^[1] 

①慢週期性，表現為活體細胞標記滯留。

②自我更新能力，表現為體外培養時細胞可呈克隆狀生長，大約能進行140次分裂，產生1×10⁴⁰個子代細胞。

③對皮膚基底膜的黏附性，主要通過表達整合素實現。 ^[1] 

顯微鏡下表皮幹細胞形態較為原始，體積小，核大，核漿比例大，流式細胞儀分析表皮幹細胞多數處於靜止期、DNA合成前期，其分裂增殖活動相對靜止(在活體內注射³H標記的脱氧胸苷或溴化脱氧尿苷(BrdU，可標記細胞的DNA)後其標記可在表皮幹細胞中長期保持不變，而其他如短暫增殖細胞等隨着細胞的不斷分裂增殖其標記很快被稀釋至逐漸消失)。體外培養時幹細胞體現了無限的增殖能力，呈克隆狀生長。 ^[1] 

整合素包括α和β兩種亞基，幹細胞高水平表達3種整合素家族：α2βl，α3β1和α5β1。各種整合素作為受體分子與基底膜各種成分的配體結合，是幹細胞維持其特性的基本條件，由於表皮幹細胞及短暫增殖細胞表面高表達β1整合素，而有絲分裂後細胞及終末分化細胞不表達β1整合素，因而可以用β1整合素的抗體來鑑別表皮幹細胞及暫時增殖細胞。

Cotsarelis等研究證實表皮中β1整合素高表達的基底細胞數目大於實際幹細胞數，故β1整合素作為鑑別皮膚幹細胞的表面標誌，仍有待進一步研究。 ^[1] 

角蛋白是表皮細胞的結構蛋白，隨着分化程度的不同，表皮細胞表達不同的角蛋白，因而可用於鑑別表皮幹細胞、短暫增殖細胞和終末分化細胞。表皮幹細胞表達角蛋白19；短暫增殖細胞表達角蛋白5和14；終末分化細胞表達角蛋白1和10。一般認為皮膚基底層、毛囊隆突部幹細胞角蛋白19表達陽性，但有毛髮皮膚基底層的表皮幹細胞角蛋白19表達陰性。

Roh等在實驗中發現毛囊隆突部表皮幹細胞表達角蛋白15，而且在幹細胞的分化過程中，角蛋白15表達的減少較角蛋白19表達的減少更早，角蛋白15陰性而角蛋白19陽性的細胞可能是“早期”短暫增殖細胞，在鑑別毛囊幹細胞方面，角蛋白15可能比角蛋白19更有意義。但Porter等研究結果顯示角蛋白15存在於整個毛囊根部外鞘中。 ^[1] 

①P63：P63是腫瘤抑制因子之一，結構和功能與P53類似；Pellegrini等發現在角膜緣的基底細胞有P63表達，在角膜表面的短暫增殖細胞沒有P63表達，因而認為P63是表皮幹細胞的標誌物。②CD71：CD71為表皮幹細胞表面轉鐵蛋白受體。從細胞數量、形態、分佈部位和所含標記保留細胞比例等多方面看，低水平表達CD71的那部分表皮細胞均符合表皮幹細胞特徵(由於幹細胞的慢週期性可用標記保留細胞代表表皮幹細胞)。⑧連接蛋白43(Connexin43，Cx43)：Roh等通過實驗顯示Cx43可能是兩種不同組織(角膜和表皮)幹細胞的陰性表面標誌物。③CD34：CD34是一種屬於I型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，主要在造血(祖)細胞上表達。通過實驗發現在培養條件下CD34⁺細胞比CD34^-細胞具有更強的克隆能力，證實CD34⁺上皮細胞比CD34^-上皮細胞具有更高的增殖潛能。此外證實CD34⁺細胞位於毛囊的隆突部，它們處於靜止期或在培養條件下有巨大的克隆能力，而且同標記保留細胞一樣，用免疫組織化學和放射自顯影法可以將CD34表達定位於毛囊的同一區域。因此這些細胞在生物學行為上與幹(祖)細胞相似，故可以將其作為鑑別具有幹細胞或祖細胞特徵的毛囊細胞的標誌物。 ^[1] 

當皮膚受到損傷時，位於皮膚表皮基底層和毛囊隆突的皮膚幹細胞就會在內外因素的調控下，及時增殖分化為相關細胞，以修復機體受損的表皮、毛囊等結構。據此人們將體外培養擴增的表皮細胞膜片或複合皮用於異體移植、燒傷或整形創面的修復。結果顯示該移植物可形成完整的表皮結構，而且培養的異體表皮細胞不發生排斥，解決了創面的早期覆蓋問題。近年來，有關成功應用複合皮移植的報道也日漸增多，即將創面上覆蓋的並體皮於3～5 d後去除表皮，在保留的真皮上植以自體表皮細胞，隨訪發現表皮在11個月後出現。可能由於培養條件的限制，基底層細胞損傷等造成的幹細胞耗竭臨牀效果不是很理想。利用纖維蛋白作為細胞培養的支持物，是皮膚幹細胞治療的重大進步，它不影響細胞的克隆形成能力及長期的增殖潛能。這樣的培養物移植可實現細胞的長期增殖，快速持久地覆蓋大面積損傷，並且費用低廉。徐榮祥等創建的原位幹細胞培植技術就是直接利用皮膚幹細胞對組織進行原位修復的。 ^[1] 

組織工程皮膚是應用組織工程學的基本原理和方法，將體外培養的細胞擴增後吸附於一種生物相容性良好並被人體逐步吸收的細胞外基質上，對其進行構建和移植，從而實現創傷的修復和重建。大面積Ⅲ度燒傷、廣泛瘢痕切除、外傷性皮膚缺損、皮膚癌以及皮膚潰瘍等導致的嚴重皮膚缺損，就可利用組織工程皮膚對其進行治療。應用於細胞培養的細胞外基質是種植、支持、轉運細胞的三維支架，有3T3細胞、聚烏拉坦、透明質酸、纖維蛋白膠與脱細胞真皮等。隨着科學的不斷進步，利用組織工程皮膚治療皮膚損傷疾病的效果日漸改善，已成為臨牀皮膚大面積損傷患者皮源缺乏的根本途徑，然而仍存在一些問題有待解決，如自體細胞在體外培養所需週期較長(大約一兩週)，不適於急性傷口的治療；異體或異種細胞移植後仍有延遲排斥反應的存在等。 ^[1] 

幹細胞除應用於外傷性皮膚缺損以及皮膚潰瘍等導致的嚴重皮膚缺損的移植治療外，還可以用來研究基因的作用以及某些疾病發病的基因機制，同時也可以用來對一些遺傳性皮膚病進行基因治療，包括導入標誌性基因或一個異源基因，使細胞內原有基因過度表達(增加功能)，或基因打靶(失去功能)以及誘導某個基因的突變等。由於表皮的不斷更新，必須對幹細胞進行基因轉染以確保外源基因在表皮細胞的長期表達。為使外源基因在足夠多的幹細胞中表達，而不是在短暫增殖細胞中表達，需將表皮幹細胞與短暫增殖細胞分離開，這是實現基因治療的重要環節。 ^[1] 

皮膚幹細胞的分化發育受多種因素，主要分為細胞內調控和細胞外調控兩大類。細胞內調控主要指細胞內的一些結構蛋白、結構因子、轉錄因子、端粒酶等通過各種方式對幹細胞的增殖分化進行調控；細胞外調控是指幹細胞所處的微環境及基板的變化，以及相鄰細胞對幹細胞的影響都會影響皮膚幹細胞的增殖分化。 ^[2] 

轉錄因子Tcf/Lef家族的調控 在胚胎早期發育中，上皮幹細胞的發育受聯合轉錄因子編碼調控。最典型的轉錄因子是Tcf/Lef家族，它對上皮幹細胞的增殖分化起着非常重要的作用。Tef/kf家族是Wnt信號通路的中間介質，當細胞內黏附因子β-catenin堆積時，可激活其介導的轉錄，促進細胞增殖；而當β-catenin分解加速時，誘導上皮細胞分化。 ^[2] 

端粒酶的調控正常動物體細胞中端粒酶處於靜止狀態；而在幹細胞中，端粒酶RNA表達較高，端粒酶處於活化狀態，隨着幹細胞的分化，端粒酶活性逐漸降低，至終末分化細胞已檢測不出端粒酶活性。缺乏端粒酶的小鼠到第六代時出現了脱毛、傷口上皮再生障礙、造血幹細胞再生受阻等異常，表明端粒酶水平的高低直接影響上皮幹細胞的增殖和分化。 ^[2] 

信號轉導通路絲氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶等信號通路在幹細胞的增殖和分化調控中起關鍵作用。最近發現與癌基因有關的Wnt、HH(hedgehog)傳導通路與上皮幹細胞的增殖分化密切相關，引起很多學者的高度重視，並且進行了大量研究。 ^[2] 

除細胞內源性調節外，皮膚幹細胞增殖和分化還受其周圍組織及細胞外基質等外源性因素影響。主要包括整合素及細胞外基質、細胞分泌因子調控。 ^[2] 

整合素及細胞外基質 整合素家族是介導幹細胞與細胞外基質黏附的最主要的分子，它與其配體相互作用為幹細胞的分化、增殖提供了適當的微環境，並控制幹細胞的增殖和分化。當幹細胞微環境發生改變時，胞外某些信息可通過整合傳遞給幹細胞，以觸發跨膜信號轉導，調控細胞的基因表達。這一過程可改變幹細胞的分裂方式，而且可激發幹細胞的多潛能性，使幹細胞產生一種或多種定向祖細胞，以適應組織修復的需要。因此，整合素也可認為是創傷癒合過程中的應急受體。基因敲除研究表明，整合素異常表達時影響表皮和毛囊發育，並引起表皮水皰。β1一整合素正常表達時，可介導幹細胞與細胞外基質黏附，抑制幹細胞分化。當β1一整合素喪失其功能時，表皮幹細胞脱離微環境的制約，分化成角質細胞。皮膚表皮幹細胞脱離幹細胞羣落分化階段的一個標誌是：表面整合素水平下降，細胞失去對基底膜的黏附。所以整合素的表達及幹細胞的黏附性是維持幹細胞羣落所必需的條件，二者的缺失將導致幹細胞停止自我更新而進入終末分化。此外，細胞外基質可通過調節β1一整合素的表達、基底膜成分的變化和微環境中分泌因子的水平來控制皮膚幹細胞的增殖和分化。 ^[2] 

細胞分泌因子的調控 幹細胞的細胞膜表面存在多種細胞因子受體，當細胞因子與其受體結合後，使受體結構發生改變，引起一系列變化，從而調控皮膚幹細胞的增殖和分化。角質細胞生長因子，表皮生長因子，轉化生長因子和抑制性信號物質(如腎上腺素)等都參與皮膚增殖調控。例如，角質細胞生長因子與其受體結合後可促進其受體的二聚體化以及自身的磷酸化，然後通過酪氨酸激酶受體G陰結合蛋白MAPKKK/MAPKK/MAPK信號級聯傳導系統調節早期的基因表達，促進表皮細胞分裂增殖。角質細胞生長因子是成纖維細胞分泌的，因而成纖維細胞對皮膚幹細胞的增殖分化提供了重要的微環境。 ^[2] 

細胞間的調控質細胞是皮膚幹細胞的微環境的重要組成部分，它可以產生多種調節因子，同時也具有多種細胞因子的受體，能在局部結合和聚集外來的細胞因子，形成不同細胞因子的不同濃度的分佈區域，即“壁龕”結構，其中的調節因子的分佈和濃度是變化的，所以該結構不是固定的，而是動態變化的。基質細胞還通過細胞間直接接觸產生對皮膚幹細胞增殖分化進行調控的信號。例如，穿膜蛋白Notch與其配體Delta或Jagged結合，促進其不斷增殖；當Dotch活性被抑制時，皮膚幹細胞進入分化，發育成功能細胞陰。Dotch是一種細胞間發生作用的保守的調控細胞分化的膜蛋白受體j高表達Dotch及配體Dehal可認為是幹細胞表面分子特徵。所以，皮膚幹細胞是在細胞一細胞、細胞一間質水平上依賴周圍微環境進行發育的。 ^[2]