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疫苗佐劑
鎖定
疫苗佐劑(Adjuvant)是能夠非特異性地改變或增強機體對抗原的特異性免疫應答、發揮輔助作用的一類物質。佐劑能夠誘發機體產生長期、高效的特異性免疫反應，提高機體保護能力，同時又能減少免疫物質的用量，降低疫苗的生產成本。長期以來，傳統疫苗(多為菌體或其裂解物)由於其免疫原性強，佐劑的研究和使用只侷限於較小的範圍，如毒素和類毒素。從巴斯德至今近百年來已開發了許多菌苗和疫苗，但傳統的菌疫苗一般多為全細菌或全病毒製成，其中含有大量非免疫原性物質，這些物質除具有毒副作用外也具有佐劑作用。所以一般不需要外加佐劑，因此在這段時間裏免疫佐劑並未引起人們廣泛的注意。直到1925年，法國免疫學家兼獸醫學家GastonRamon發現在疫苗中加入某些與之無關的物質可以特異地增強機體對白喉和破傷風毒素的抵抗反應
[1]
，從此許多國家都不同程度的開展了這方面的研究。隨着現代生物技術和基因工程技術的迅速發展，針對不同疾病已開展了各種新型基因工程疫苗的研製，但這些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、難以誘導機體產生有效免疫應答等不足，從而需要某種物質來增強其免疫作用，免疫佐劑尤其是新型免疫佐劑的研究就顯得尤為迫切。近年來，為適應新型疫苗的需求，佐劑已經從傳統、單一的形式向新型、多元化形式發展，尤其用於黏膜疫苗、DNA疫苗及腫瘤疫苗的佐劑研究成為熱點。
- 中文名
- 疫苗佐劑
- 外文名
- Vaccine adjuvant
- 包 括
- 抗獨特型抗體疫苗,核酸疫苗
- 特 點
- 純度高,相對分子量小
疫苗佐劑疫苗佐劑的概念
佐劑(Adjuvant)又稱免疫調節劑或免疫增強劑(Immunepotentiator)，起源於拉丁文“Adjuvare”，是輔助或者增強的意思。佐劑是疫苗的一種添加劑，當它先於抗原或與抗原混合注入機體後，能夠增強機體對抗原的免疫應答或者改變免疫反應的類型，屬於非特異性的免疫增強劑，而其本身無抗原性。理想的佐劑不僅能夠增強免疫反應，而且能使機體獲得最佳的保護性免疫
[2]
。
疫苗佐劑疫苗佐劑的種類
疫苗佐劑鋁佐劑
1926 年，鋁佐劑的佐劑活性被證實，廣泛使用至今，已有 90 多年。鋁佐劑是一種乳白色的凍膠狀半固體，目前常見的鋁佐劑有氫氧化鋁凝膠、磷酸鋁、硫酸鋁、銨明礬及鉀明礬等，但常用的是 Al( OH) 佐劑。 Al( OH) 3 的應用非常廣泛，是目前唯一被國際開發協會( IDA) 批准的可應用於人類和獸類的免疫佐劑。該佐劑具有抗原吸附的作用，能夠從溶液中將蛋白質抗原吸附，最終形成抗原沉澱。當將其注射到機體內後就可以緩慢將抗原釋放出，從而大大延長了抗原作用的時間，同時還能促進注射部位巨噬細胞的應答。
但鋁佐劑也存在其不足之處，與其他應用的佐劑相比較產生較弱的免疫應答，且不能參與細胞免疫應答; 有研究揭示鋁佐劑在白鼠體內可進入大腦，存在風險。誘導產生的免疫反應類型有偏向性( Th2 型) 、局部反應重等。
疫苗佐劑油乳佐劑
1936 年，油乳佐劑被成功開發，弗氏完全佐劑研發問世。油乳佐劑最主要的成分是油料。根據所用油料的區別可將油乳佐劑分成礦物油佐劑和非礦物油佐劑兩種。這類免疫佐劑可以促進多種抗原產生高效價的抗體，使抗原連續刺激的時間相對延長，抗原接種的劑量減少，抗原接種的次數降低，因為這些優點，油乳佐劑在動物疫苗中得到了廣泛的應用。但是這種佐劑在生物機體內起作用的同時也會伴隨着一些安全隱患，如造成組織損傷、應激反應、礦物油的殘留，以及可能致癌等。
油乳的主要作用機制可以解釋為: ( 1) 特異性抗原被油包裹，從而可以緩慢釋放，並且被油包裹住的抗原還可以避免被酶解，進而可以不間斷的使機體產生高效的特異性免疫應答; ( 2) 油可以刺激機體局部產生炎症反應，有助於刺激免疫細胞使其增殖，從而提高機體的免疫應答水平。
目前市場上常見的油乳佐劑主要有弗氏佐劑、白油 Span 佐劑、MF-59、ISA 206、ISA 720、佐劑-65、SAF 等，其中獸用疫苗多用油包水型佐劑，人用疫苗多用水包油佐劑。油佐劑在與疫苗配合使用時都要經過乳化這一過程，常見的乳化設備有立體膠體磨、高壓勻漿泵、罐內剪切機及乳化罐等。不同的油佐劑有不同的乳化工藝。以ISA 206 乳化工藝為例，佐劑與抗原配比為質量比 1∶ 1，滴加時將油相和水相温度調整合適，抗原滴加速度為160 萬 ml / h，滴加時攪拌速度為 80r / min。乳化過程中均質壓力調整合適的低壓、高壓。一般均質後温度為29℃ ，分裝前降温至 15℃ 。
疫苗佐劑微生物來源的佐劑
微生物作為佐劑能夠增強機體免疫應答很早之前就有報道。20 世紀 50 年代，革蘭氏陰性菌的脂多糖被證實具有免疫佐劑的功效。隨着對微生物類佐劑研究的不斷深入，越來越多的微生物被證實具有佐劑功效， 目前已被發現具有佐劑功效的微生物類佐劑大致有: 分枝桿菌及某些百日咳桿菌、綠膿桿菌、布氏桿菌、大腸桿菌、魏氏梭菌的脂多糖及結核桿菌素等; 革蘭氏陽性菌有葡萄球菌、短小棒狀桿菌、鏈球菌、乳桿菌等。實驗表明，當這些微生物或其產物與免疫疫苗同時注入時，具有明顯增強機體特異性免疫應答的功效。但是細菌成分一般都具有毒性，所以這也是微生物類佐劑難以成為人用疫苗佐劑的重要原因之一。
疫苗佐劑蜂膠佐劑
20 世紀 60 年代，蘇聯科學家對蜂膠的佐劑活性進行了研究，證實了蜂膠具備免疫佐劑活性。蜂膠是蜜蜂首先在植物芽孢或樹幹上採集樹脂，然後將採集好的樹脂經過一系列的處理後所形成的一類具有芳香氣味的膠狀固體物。蜂膠的成分極其複雜，代表性的成分有黃酮類化合物、多種氨基酸、芳香揮發油、維生素及多種微量元素等。蜂膠其本身並不會加強機體的免疫應答，然而當其與疫苗同時使用時就可以發揮佐劑的功效，增強機體的免疫應答，是一類天然的免疫增效劑，而且其還具備抑菌的功效。與傳統佐劑相比，如油乳佐劑，蜂膠佐劑具有更高的安全性。
疫苗佐劑左旋咪唑佐劑
1971 年，Ｒenoux 等發現左旋咪唑與免疫疫苗配合使用可以增強免疫效果。自此，人們開始了對左旋咪唑佐劑活性的研究。左旋咪唑是經消旋四咪唑和 d-樟腦-10-磺酸環合後經過將其水解成鹽而得到的咪唑衍生物。在獸醫臨牀上被廣泛應用於抗蟲，主要的作用對象是蛔蟲和鈎蟲。研究表明，左旋咪唑有免疫佐劑的功效，可以配合免疫疫苗使用從而提高機體的免疫應答效力。其可以誘導 T 細胞分化，使 T 細胞轉化成致敏的 T 細胞，接而產生 MHF 和 MIF 等淋巴因子，最終進一步活化巨噬細胞。當外周免疫細胞、T 細胞、巨噬細胞和中性細胞的功能受到損傷時，左旋咪唑可恢復受損功能。左旋咪唑一般副作用比較小，但是長期使用會引起腹瀉及肝損傷等。
疫苗佐劑脂質體佐劑
1974 年，Allison 等首次報道脂質體具有免疫增強劑的功效。脂質體經卵磷脂和神經酰胺等製得，特點是具有雙分子層結構，研究表明，磷脂的酰基鏈越長、飽和度越高，其增強機體的免疫應答效果越明顯。它作為佐劑的同時還具備載體的功能，與細胞膜的微球體相類似。
脂質體作為佐劑具備許多優點: ( 1) 脂質體的安全性非常高，因為它是由一類類細胞膜材料構成的，所以脂質體完全可以被生物降解，沒有殘留。( 2) 磷脂的結構同時包含親水性基團與親脂性基團，無論是親水性抗原還是親脂性抗原都可以被其包封，所以脂質體具有廣泛的應用性。( 3) 被脂質體包封的抗原可以避免被降解，從而可以緩慢連續釋放抗原，持續刺激機體產生特異性免疫應答。( 4) 脂質體可以凍幹保存。
雖然脂質體具有如此多的優點，其缺點也不容忽視，主要表現在以下兩個方面: ( 1) 雖然脂質體安全性很高，但它也存在部分輕微的副作用; ( 2 ) 脂質體對抗原的包封率不是很均一，其對有些抗原的包封結果不理想，所以就很難發揮疫苗的免疫作用。
疫苗佐劑中藥佐劑
1984 年，QuilA 被報道具有免疫增強劑的效果。QuilA 是從南美皂樹的樹皮中提取的一類皂苷。但是其具有很強的副作用，具有很強的毒性，不僅能引起肉芽腫，還會引起溶血現象。隨着研究的深入，越來越多的中藥成分被應用於疫苗中充當佐劑，常見的用作佐劑的中藥成分有皂苷類、中藥中的多糖成分和中藥複方。( 1) 皂苷是一種甾體或三萜配糖類物質，它廣泛地存在於陸地高等植物中，也有為數不多的存在於低等海洋動物與一些細菌之中。許多皂苷類成分可以充當佐劑，有些皂苷還有抑菌作用，且安全性較高。( 2) 中藥多糖成分同樣可以充作良好的佐劑，多糖是至少 10 個單糖經過糖苷鍵連接形成的糖鏈，常見的含有多糖成分的中藥材有天麻、甘草、黃芪、冬蟲夏草和靈芝等。這類多糖成分的副作用極低，無細胞毒性，不會抑制骨髓造血細胞的繁殖，也不會使機體抗感染能力下降。( 3 ) 中藥複方也有充當佐劑的潛力，有實驗表明玉屏風散、四君子湯、金雞散、黃連解毒湯等複方中藥與免疫疫苗同時使用時，明顯提升了動物血清中的抗體效價，這表明中藥複方可以增強機體免疫效果，作為疫苗佐劑有一定的發展潛力。
疫苗佐劑小肽類佐劑
小肽類佐劑是近幾年來發現的可以增強免疫效力、具備佐劑功效的一類物質。它是由菌分泌在上清中，通過截留可以獲得的小於 10kDa 的肽段。通過動物免疫實驗發現，小肽明顯提升了機體產生抗體的效價，具備佐劑功效。小肽作為佐劑具備很多優勢: 獲取簡單; 便於儲存與運輸; 因為是益生菌所分泌，所以對機體無害，安全性高，有望作為人用疫苗佐劑。
疫苗佐劑疫苗佐劑的作用機制
抗原存儲庫效應
在機體局部注射抗原後，佐劑將過多的抗原募集並儲存，並緩慢連續釋放，通過這種方式使抗原連續刺激時間延長，從而提高抗體效價，提高機體免疫應答效果，如脂質體佐劑等。
使細胞因子和趨化因子表達上調，於注射位點募集免疫細胞
細胞因子是指由機體細胞經刺激而合成、分泌的一類小分子蛋白質。它具有廣泛生物活性，很低的水平就可以表現出生物學活性，是細胞間信號傳遞分子， 其通過結合相應的受體調控免疫應答。趨化因子是指能夠將白細胞遷移到感染部位的一些低分子量(多為8 ～ 10kDa) 的蛋白質( 如 IL-8、MCP-1 等)。在免疫應答中，細胞因子和趨化因子扮演着重要的角色，上調細胞因子和趨化因子表達能夠使機體的免疫效應增強，如微生物類佐劑、MF59 等。
增加抗原的表面積
一些抗原體積小、相對分子質量低，不足以誘導免疫應答，佐劑通過將其包裹，增加了抗原的分子量及表面積，從而增強了抗原的免疫原性，如油乳佐劑等。
載體作用
一些佐劑可以起載體的作用，將抗原包裹，避免抗原被酶降解，從而可以連續釋放抗原，增加抗體效價，如鋁佐劑等。
促進樹突狀細胞的活化與成熟，使抗原提呈增強
樹突狀細胞( dendritic cell，DC) 是機體功能最強的專職抗原提呈細胞( antigen presenting cell，APC) ，它可以有效地攝取、加工處理和提呈抗原。某些佐劑可以促使樹突狀細胞活化成熟，從而使抗原提呈加強，增強機體的免疫應答，如油乳佐劑等。
激活炎性小體
炎性小體( inflammasome) ，又稱炎症小體，是由多種蛋白質組成的複合體，是天然免疫系統的重要組成部分，分子量約為 700kDa。炎性小體能夠調節胱冬肽酶-1( caspase-1) 的活化進而在天然免疫防禦的過程中促進細胞因子前體 pro-IL-1β 和 pro-IL-18 的切割成熟［46］。炎性小體還能調節 caspase-1 依賴的形式編程性細胞死亡，誘導細胞在炎性和應激的病理條件下死亡，如鋁佐劑等。
疫苗佐劑現行疫苗佐劑存在的問題
疫苗佐劑安全性問題
佐劑的安全性是一個十分重要的問題，但又是一個容易被忽視的問題，研究表明，絕對安全的佐劑是不存在的。人們只能根據佐劑的作用機制進行調整，儘可能做到免疫刺激作用最大化，而毒副作用最低化。臨牀觀察設計時，要充分考慮佐劑、佐劑與疫苗使用引起的不良反應的收集。如果是新佐劑與已上市抗原的臨牀研究，應有與已上市疫苗(佐劑和抗原)不良反應的比較和分析。如果是新佐劑與新抗原，則應按照國家有關要求，系統而詳細地收集不良反應，包括局部和全身反應、有關係統的實驗室檢測指標和儀器檢查結果等。
疫苗佐劑局部副反應
一些佐劑可誘導強烈的抗體應答和細胞免疫，但仍有個別試驗者接種後出現較強的局部副反應，反應出現頻率具有抗原或劑量依賴性。疫苗佐劑的質量控制是直接關係其臨牀試驗安全性的關鍵因素。如在1945～1960年疫苗研究中廣泛應用的FIA，因其某批次出現質量問題導致膿腫發生大量增加而最終於1960年後期被終止使用。儘管該佐劑具有較強的佐劑效應，但其不安全因素限制了進一步發展，這種不安全因素主要與其使用劑量以及組份中礦物油化學鏈長度相關。
疫苗佐劑其它問題
除了上述兩個主要問題外，佐劑還存在一些問題：如油佐劑較粘稠不利於注射、乳化不好容易分層、同時在注射局部反應較嚴重；氫氧化鋁佐劑難以誘導弱抗原的免疫反應且不能誘導細胞免疫；脂多糖佐劑存在較強的毒副作用、脂質體的穩定性有待提高，氧化甘露聚糖與抗原結合方式侷限、蜂膠佐劑注射部位形成腫塊等問題。某些佐劑作用機制的認識仍不夠深入，使得新型佐劑的進一步發展困難重重。另外一些佐劑由於製備過程複雜，價格昂貴也限制了它們的推廣應用。
疫苗佐劑疫苗佐劑的臨牀前和臨牀研究要點
1.佐劑對疫苗免疫原性的影響
首先,必須證明佐劑確實能夠有效誘發機體產生長期、高效的特異性免疫反應,提高機體保護能力,這是佐劑應用的基礎。如果研究結果顯示加入佐劑對免疫原性的增強效果甚微,則不應加入,以避免佐劑帶來的其他副反應。免疫效果應包括體液免疫和細胞免疫兩個方面。體液免疫除檢測功能性抗體(中和、調理吞噬或殺菌抗體)外,還應檢測免疫球蛋白的亞類。細胞免疫應檢測抗原特異性T細胞反應,包括Th1、Th2和T細胞調節因子和（或）有關的細胞因子等。
2.佐劑的毒理學及藥理學
佐劑的毒理學方面,主要考慮接種部位的病理反應、機體產生的抗體反應、抗體持續時間等。目前我國批准用於疫苗的佐劑為氫氧化鋁,而鋁佐劑通常使疫苗產生抗體的時間滯後,且增加註射局部的副反應發生率。如疫苗的抗原量能滿足免疫的需要,則建議不加佐劑。佐劑的藥理學試驗主要應考慮發生作用的原理、作用結果與劑量的關係、免疫程序和接種途徑與效果的關係等。
3.佐劑與疫苗中各成分的相互作用
佐劑作為疫苗成分中的一部分,應該與其他成分相容,如佐劑與防腐劑、佐劑與非活性成分等。並應考慮佐劑對不同成分吸附作用的影響,吸附後是否有解離及解離程度、各組分的添加順序對吸附產生的影響等。
4.佐劑單獨給藥時人體內的代謝
新疫苗佐劑,包括已上市的佐劑,改變用量或給藥途徑,需要充分的臨牀前安全性數據的支持。同時考慮佐劑可能會在體內蓄積,還應進行佐劑單獨給藥時的人體藥代動力學研究。人體藥代動力學研究的設計應依據臨牀前研究資料,根據佐劑的性質和特點進行,以獲得科學的、令人信服的結果。
5.佐劑的劑量
佐劑的使用劑量以及佐劑與抗原的比例,關係到是否能夠誘導出所需的免疫應答反應和儘量減少不良反應。對於新佐劑和已上市的抗原結合物的劑量範圍,應參照已上市同類產品的用量。對於新佐劑和新抗原的結合物,既要研究佐劑的用量,也要注意選擇佐劑與新抗原的最佳比例。應儘可能在疫苗的目標人羣中進行研究,並設計多個劑量組。
6.免疫增強效果
臨牀觀察應遵循GCP原則,設計時不僅應隨機、雙盲、設置對照,而且還應結合抗原和佐劑的特性。應在目標人羣中進行觀察,如果年齡組的跨度較大,在設計中應事先進行分層或進行一個以上的臨牀觀察。對於大多數臨牀觀察,尤其是如果已獲得上市許可的疫苗抗原量發生了變化,則需要重點評價與保護有關的有效性免疫指標。如果沒有,就要對其免疫保護效果進行評價。對於新佐劑新抗原疫苗,還要採用預防同樣疾病的上市疫苗作為對照。如果沒有,也可採用目標人羣可用的、其他不相關的疫苗作為安慰劑對照。必要時,還應設立多組對照。樣本量應滿足統計學要求。對非劣效試驗,必須事先設定非劣效的界值,並提供設定的依據。在設計臨牀觀察使用的分析方法和樣本量大小時,還應適當考慮多因素影響的問題。
7.局部和全身反應
研究表明,絕對安全的佐劑是不存在的。人們只能根據佐劑的作用機制進行調整,儘可能做到免疫刺激作用最大化,而毒副作用最低化。臨牀觀察設計時,要充分考慮佐劑、佐劑與疫苗使用引起的不良反應的收集。如果是新佐劑與已上市抗原的臨牀研究,應有與已上市疫苗(佐劑和抗原)不良反應的比較、分析。如果是新佐劑與新抗原,則應按照國家有關要求,系統而詳細地收集不良反應,包括局部和全身反應、有關係統的實驗室檢測指標和儀器檢查結果等。
疫苗佐劑疫苗佐劑的發展方向
長期以來，佐劑研究被認為是疫苗行業的“dirtvlittle secrets”，這主要是人們對佐劑的作用機制瞭解較少。從設計理念來看，早期的疫苗佐劑鋁鹽和乳劑，其機制主要在於延緩抗原清除、緩釋免疫原和提高抗原被攝取的數量。近年來，現代免疫學的發展尤其是對於固有免疫知識的積累，在一定程度上加速了疫苗佐劑的開發。這些免疫佐劑多靶向於模式識別受體。模式識別受體是免疫細胞表達的，與病原微生物或細胞應急相關的蛋白。典型的模式識別受體可以分為五類，包括Toll樣受體(TLRs)，RIG-I樣受體(RLRs)，NOD樣受體(NLRs)C型凝集素受體(CLRs)和DNA感受器(如STING等)。以新型佐劑為代表的疫苗突破了傳統以鋁佐劑為主誘導Th2免疫反應類型、應答慢、持久性差等的瓶頸。
達到既可以誘導高水平持久性抗體，又能誘導極強的Th1型免疫反應的理想目標。其代表有CpG佐劑的乙肝疫苗、QS21+MPL的水痘帶狀皰疹病毒疫苗我國在基幹模式識別受體的佐劑研究方面也有很多亮點工作，例如北大的蔣爭凡教授發現錳離子有很好的STING激活作用，其開發的以納米膠體形式存在的二價錳有優秀的疫苗佐劑效果。從細胞層面上，這些疫苗佐劑通過激活模式識別受體而活化了抗原呈遞細胞(主要是樹突狀細胞)，將抗原的信號有效地傳遞給效應T細胞，從而起到調節抗原相關免疫應答的作用。整體上新型佐劑研究都是基於模式識別受體或所謂的炎症效應到共刺激分子的方法學。
佐劑設計需要跳出已有思維侷限，發掘新方向。可以預見除了代謝通路外，激酶等其他藥物靶點也可以被用來開發小分子佐劑，活化天然免疫。
佐劑作用原理的核心在於促講病原體的多肽抗原被獲得性免疫識別，產生特定的抗體和細胞應答。因此，任何能促進這一過程的因素都有可能被利用幹發展新型的佐劑分子。例如，完整的免疫應答需要經過抗原遞呈細胞，T細胞以及B細胞進行，未來可以設計針對這其中的多個環節，包括抑制免疫反應的負反饋，如靶向PD1、PDL1以及CTLA4等免疫檢查點、抗原遞呈細胞以及T細胞的凋亡：T細胞衰竭，Trea以及MDSC等抑制性細胞等諸多方面:另一方面也可以發展直接針對T細胞以及B細胞的免疫刺激劑。同時，艾滋病、寄生蟲等疫苗的成功往往需要誘導特定的細胞應答。例如，yO-T細胞在瘧原蟲疫苗誘導的免疫保護中起著重要作用，而目前的小分子佐劑都不能誘導vδ-T細胞活化。無疑，未來的疫苗佐劑需要向多樣化、精細化的方向發展，這些對藥學研究提出了更高的要求，需要針對免疫的精細調節發展安全、有效的小分子化合物
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