產甲烷菌

產甲烷菌是一類能夠將無機或有機化合物厭氧發酵轉化成甲烷和二氧化碳的古細菌。產甲烷菌是重要的環境微生物，在自然界的碳素循環中起重要作用。 ^[1] 

1979年，Balch和Wolfe通過16S rRNA測序 將產甲烷菌發展為3目（甲烷桿菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目）4科7屬14種。1993年，Boone將甲烷八疊球菌科上升為一個目，建立了火熱產甲烷菌目，至此產甲烷菌發展為5目10科25屬59種。2001年，Bergey's Manual of Systematic Bacteriology將產甲烷菌放在寬廣古生菌門（Euryarchaeota）中，至此產甲烷菌發展為3綱，5目，10科，26屬，78種。產甲烷菌屬於古菌域（Archaea），廣域古菌界（Euryarchaeon），寬廣古生菌門（Euryarchaeota）。人們對產甲烷菌的認識約有150年的歷史。人們對產甲烷菌有極大的興趣是在於產甲烷菌對天然氣的形成，在自然界與水解菌和產酸菌等協同作用，使有機物甲烷化，產生有經濟價值的生物能物質——甲烷。

產甲烷菌是嚴格厭氧的微生物，在嚴格厭氧技術發明之前，產甲烷菌的分離培養研究進展緩慢。巴氏甲烷八疊球菌(Methanosarcina barkeri)和甲酸甲烷桿菌(Methanobacterium formicium)是最早分離出的產甲烷菌微生物；1950 年 Hungate 厭氧分離技術的使產甲烷菌的研究得到迅速的發展。1974年《伯傑氏鑑定細菌學手冊》第八版以產甲烷菌的形態作為分類依據，將其描述為一個獨立的科。 ^[2]  第九版《伯傑系統細菌學手冊》中產甲烷菌的分類以系統發育的方法劃分，包括 5 個大目：甲烷桿菌目(Methanobacteriales)、甲烷球菌目(Methanococcales)、甲烷 八 疊 球 菌 目(Methanosarcinales)、甲 烷 微 菌 目(Methanomicrobiales)和甲烷火菌目(Methanopyrales)(Liu and Whitman, 2008; 陳森林, 2010)，每個目的產甲烷菌包含多個科屬，現已命名的 10 科、31 屬分屬上述5個目的產甲烷菌。 ^[3] 

近年來，隨着厭氧分離技術的改進，結合先進的鑑定手段和分析方法，更多種類的產甲烷菌菌株被鑑定出來。在分類學上，產甲烷菌被分別描述為甲烷桿菌綱(Methanobacteria)、甲烷球菌綱(Methanococci)、甲烷微菌綱(Methanomicrobia)和甲烷火菌綱(Methanopyri)，這4 個綱包括 7 目、14 科、35 屬。其中甲烷微菌綱(Methanomicrobia)有 4目、9科、25屬，是研究最多的產甲烷微生物類羣。 ^[4] 

甲烷的生物合成有 3 種途徑，包括以乙酸為底物，以 H₂/CO₂ 為底物，以甲基類化合物為底物的生物合成過程。研究表明，以乙酸鹽為底物產生的甲烷佔自然界甲烷量的 67%，而以 H₂/CO₂轉化形成的甲烷不足自然界甲烷量的33%。很多獨特的酶類參與甲烷生成過程，這些酶類主要有氫化酶、輔酶F420、甲酰甲基呋喃、甲酰四氫甲基喋呤、輔酶 M 等，通過監測產甲烷過程中的獨特酶類，可以從本質上認識產甲烷菌的代謝規律。三種甲烷合成途徑最終都形成甲基輔酶 M，甲基輔酶 M 在甲基輔酶 M 還原酶Ⅰ (MCR Ⅰ)和甲基輔酶 M 還原酶Ⅱ (MCR Ⅱ)的催化下最終形成甲烷。 ^[4] 

產甲烷菌的細胞結構：細胞封套（包括細胞壁、表面層、鞘和莢膜）、細胞質膜、原生質和核質。

產甲烷菌有革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，它們的細胞壁結構和化學組分有所不同。也是與真細菌的區別點。

細胞封套有四種：

1.大多數G+產甲烷菌的細胞壁在結構上與G+真細菌相似，細胞壁有一層和三層的，單層的厚度為10～20nm，如甲烷桿菌屬與甲烷短桿菌屬。巴氏甲烷八疊球菌的細胞壁只有一層，厚約200nm。它們化學成分與G+真細菌的不同，不含細胞壁（即不含二胺基庚二酸或細胞酸）而是假細胞壁質或是未硫酸化的異多糖。三層的細胞壁壁厚為20～30nm，有內層、中層和外層。外層在細胞分裂橫隔形成時消失，如瘤胃甲烷短桿菌。

2.G+的熾熱高温甲烷菌的細胞壁外有一層六角形的蛋白質亞基即S層覆蓋。

3.G-產甲烷菌不具有球囊多聚物或外膜。只有一層六角形或四角形的，由蛋白質亞基或糖蛋白亞基組成的S層。

4.甲烷螺菌的細胞質膜外只有一層由蛋白纖維組成的鞘包裹幾個細胞。其厚度為10nm。

1.營養特性：甲烷細菌的能源和碳源物質主要有5種，即H₂/CO₂、甲酸、甲醇、甲胺和乙酸。

2.特殊輔酶：F420：是黃素單核甘酸的類似物，分子量為630的低分子量熒光化合物。它是甲烷細菌持有的輔酶，在形成甲烷過程中起着重要作用。

其特點：(1)當用420nm波長的紫光照射時，能產生自發藍綠熒光，這一現象可藉以鑑定甲烷細菌的存在。（2）中性或鹼性條件下易被好氧光解，並使酶失活。

CoM:2-巰基乙烷磺酸.

其特點：（1）它是甲烷細菌獨有的輔酶，可藉以鑑定甲烷細菌的存在。（2）它在甲烷形成過程中，起着轉移甲基的重要功能。（3）其具有RPG效應。即促進CO₂還原為CH₄的效應。

3.環境條件：氧化還原電位：參與中温消化的甲烷細菌要求環境中應維持的氧化還原電位應低於一350mV；對參與高温消化的甲烷細菌則應低於-500~-600mV。

温度：低温菌的適應範圍為20~25°C，中温菌為30~45°C，高温菌為45~75°C。

pH：大多數中温甲烷細菌的最適pH值範圍約在6.8~7.2之間。

毒物：凡對厭氧處理過程起抑制或毒害作用的物質，都可稱為毒物。

產甲烷菌是專性厭氧菌，它分離和培養等的操作均需要在特殊環境和用特殊的技術進行。

一般要求不高的可用在液麪加石蠟或液體石蠟的液體深層培養法、抽真空的培養法、在封閉培養管中放入焦性沒食子酸和碳酸鉀除去氧的培養方法（Berker）、Hungate的厭氧滾管法、Hungate的厭氧液體培養法、Balch的厭氧液體培養增壓法等。

最好的是厭氧手套箱，它由四部分組成：

1.附有手套的密閉透明薄膜箱

2.附有兩個可開啓的可抽真空的金屬空氣隔離箱

3.真空泵

4.氫和高純氮的供應系統

利用厭氧手套箱可做許多工作，如：分裝厭氧培養基，倒制平板，離心厭氧微生物收集菌體，對氧敏感的酶和輔酶的分離純化，進行電泳、厭氧性生物化學反應和遺傳學研究等。