球形芽孢桿菌

球形芽孢桿菌（Bacillus phaericus，Bs）廣佈全球，是普遍存在於土壤或水域中的一種產芽孢菌，其中部分菌株具殺蟲性能。其殺蟲譜比蘇雲金桿菌為窄，一般而言，庫蚊對它最敏感，按蚊次之，多數伊蚊種類對它不敏感，對蚋的幼蟲亦無毒效。Bs在污水中有較大持效，適用於防治污水庫的淡色庫蚊和致倦庫蚊。在常用的1593、2297和2362菌株中，後者毒效一般高於前兩株。我國分離的TS-1和Bs-10菌株有類似的殺蟲毒性。研究表明，球形芽孢桿菌產生原毒素（protoxin），原毒素在蚊幼腸道中活化而成為毒素。最初合成毒素是分子量為125000的肽，在芽孢形成過程中，肽分解為分子量11000、63000和43000的蛋白質。毒性的活化有兩個過程，一是分子量125000的蛋白質轉化為分子量43000的蛋白質；二是後者在幼蟲腸道中轉化為40000的蛋白質。 ^[3] 

蘇雲金芽孢桿菌以色列亞種（Bti）和球形芽孢桿菌（Bs）是應用最廣、使用最成功的滅蚊病原微生物，其滅蚊選擇性強，對非靶生物和人畜無毒性，在自然界中易降解不污染環境。養殖場滅蚊範圍廣，排污量大，積水容器多，易孳生多種蚊類，使用Bti製劑和Bs製劑具有施藥方便、作用範圍廣等優點，能有效控制蚊蟲的孳生。 ^[2] 

球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus，Bs）與蘇雲金芽孢桿菌相比較，球形芽孢桿菌的殺蚊譜較窄，其中對庫蚊屬幼蟲的毒性最強，在污水中的藥效維持時間較長，特別適用於污水中孳生的庫蚊屬幼蟲（淡色庫蚊和致倦庫蚊）的控制。Bs製劑主要有Bsc3—41、Bs一2362、Bs一10等。Bs製劑較Bti製劑易產生抗性，但實驗證明，對Bs產生抗性的蚊幼蟲對Bti卻仍然表現出高度敏感性。因此，可以利用這一點，聯合使用兩種製劑，產生協同作用，擴大殺蚊譜，延長藥物維持時間，提高殺滅療效，並預防或延緩蚊幼蟲對Bs產生抗性。另外，隨着分子生物學技術的發展和應用，也使用包含了Bs的二元蛋白BsB和Bti的四個蛋白（Cry4A，Cry4B，Cry11A和 Cyt1A）的重組菌株，或者包含了Bs一2362和Bti兩種菌株的殺蚊毒素的重組菌株用於蚊蟲控制，經過實驗證實，可擴大殺蚊譜，藥效延長至7～21天，控蚊效果大大提高。 ^[2] 

球形芽孢桿菌對不同蚊幼蟲的毒殺作用主要是由其產生的毒素蛋白實現的。現已證明在其生長髮育過程中能產生兩類不同毒素蛋白，一類是存在於所有高毒力菌株中的晶體毒素蛋白；另一類是存在於低毒力菌株中部分高毒力菌株中的Mtx毒素蛋白。

所有高毒力和部分中毒力菌株（如LP1-G）在其芽孢形成過程中能形成位於芽孢孢外膜內的伴孢晶體。該晶體是有等量的51.4和41.9kD多肽（記為P51和P42）組成。P51和P42合成於細菌芽孢形成期，並在芽孢形成Ⅲ期通過兩蛋白的相互作用和摺疊而組裝形成晶體[4,15]。P51和P42的同時存在是形成伴孢晶體所必需的。在B.　subtilis、Bs和Bti重組子中單獨表達形成的P51和P42只能以無定形包含物形式存在；只有兩種蛋白同時表達，才能形成典型的伴孢晶體；但兩種蛋白在B.　subtilis重組子中同時表達只能形成無晶體結構的卵圓形和圓形的包含物，而只有缺失兩結構基因間的核苷酸序列的融合基因才能表達形成晶體。這説明在Bs和Bti中含有促使蛋白穩定和晶體化的因子[17～18]。 ^[1] 

Western Blot表明P51和P42蛋白間無交叉反應，説明它們之間無較強的同源性。但P51和P42在25%（90個氨基酸）位置上的氨基酸是完全相同的，其中，有4個區域的氨基酸性序列有高度的保守性，這些保守區域在兩蛋白中的功能各不相同，可能同毒素蛋白的殺蚊活性相關。 ^[1] 

在SSII-1、Kellen Q和2173等低毒力菌株及部分高毒力菌株中發現Mtx毒素[6,27～30]。這些毒素的合成同芽孢的形成不相關，它合成於細菌的營養體生長階段。mtx的啓動子同LacZ的融合實驗也表明該毒素營養體時期表達[31]。同晶體毒素相比，Mtx毒素相對不穩定，熱處理、反覆的凍熔都會嚴重影響其殺蚊活性。DNA雜交實驗證明所有的Mtx毒素同晶體毒素無同源性。 ^[1] 

Mtx1毒素：Mtx1毒素是一種100kD的可溶性毒素（記為P100），由870個氨基酸組成。它的N-末端有一個具有G+細菌信號肽特徵的序列，與ADP-核糖基轉移酶催化亞基同源；C-末端有三個約90個氨基酸末端重複序列。這種P100可以通過去掉N-末端信號肽形成97 kD蛋白，也可被蚊幼蟲中腸蛋白酶降解形成27和70kD的蛋白多肽，其中27kD含有一個同轉膜序列相對應的區域，而且同幾種ADP-核糖轉移酶毒素有弱的同源性[32]。而且缺失實驗也證明，27kD片段能自身ADP-核糖基化，70kD片段能使蚊細胞發生病理反應，只有兩種蛋白片段的同時存在，才對蚊幼蟲表現出毒性[32,33]。純化的Mtx毒素同晶體毒素的殺蚊活性相當（LC50值15　ng/mL），但由於這種毒素合成於營養體生長階段，不能形成晶體，易被細菌生長過程中產生的蛋白酶降解形成無活性的多肽成分[34]。 ^[1] 

Mtx2毒素、Mtx3毒素：Mtx2毒素和Mtx3毒素都是從SSII-1菌株中分離出的由292和326個氨基酸組成，分子量分別為31.8和35.8kD的毒素蛋白，它們同P100毒素和晶體毒素無同源性，而同產氣夾膜羧菌Clostridium perfrigens的33kD的ε-毒素及綠濃桿菌Pseudomonas aeruginos的31.68kD細胞毒素有同源性[27,29]。Mtx2和Mtx3間有38%的同源性，都含有一個G⁺細菌的信號肽和假定的轉膜區。對從6個不同Bs有毒菌株中分離的Mtx2比較分析，其氨基酸序列只有幾個氨基酸差異，對蚊幼蟲的毒性和殺蚊譜也有差異，其中224位置的氨基酸決定了該毒素殺蚊活性和殺蚊譜[35]。 ^[1] 

Charles利用電鏡詳細研究了蚊幼蟲取食孢晶混合物後中腸上皮細胞的形態學變化，在敏感的尖音庫蚊中，首先在胃盲囊和中腸後部出現電子密度低的區域，細胞形成空泡，線粒體膨大，但並未發現中腸細胞的裂解[36,37]。 ^[1] 

蚊幼蟲取食孢晶混合物後，晶體在中腸鹼性環境和蛋白酶的作用下迅速溶解，釋放出51.4和41.9kD毒素蛋白，然後進一步降解形成43和39kD的活性蛋白多肽[38,39]。在敏感和非敏感蚊幼蟲體內，晶體蛋白都能被溶解和激活，因此晶體蛋白對不同蚊幼蟲的毒性差異並不是由於晶體蛋白的溶解和激活方面的差異造成的[6,39]。 ^[1] 

用熒光素標記的不同毒素蛋白成分研究了晶體毒素在蚊幼中腸上皮細胞的結合部位[18,40]。P51不能結合到伊蚊中腸上，P42只對整個中腸進行較弱的結合；對於致倦庫蚊幼蟲，只有P51能結合到中腸部位，而P42只對整個中腸進行非特異性的結合，只有在P51存在的情況下，P42才能特異性結合到胃盲囊和中腸後部。同時缺失實驗而表明P51的N-末端和C-末端及P42的C-末端氨基酸對二元毒素同中腸的特異性結合起着重要的作用[18,41]。根據這些體內和體外的特異性結合實驗結果，提出這樣一種假設，即P51的N-末端區域同蚊幼蟲中腸上皮細胞特定區域結合，其C-末端同P42的N-末端區域相互作用，使P42也結合到相同的部位而發生毒殺作用。還不清楚二元毒素結合到中腸上皮細胞後的詳細作用機理。有人認為二元毒素通過內攝作用而進入細胞內發揮毒性[40,41]，或停留在膜上由P42在細胞膜上形成微孔導致胞內水分外流[6]。用125I-標記的活化毒素蛋白同敏感和非敏感中腸上皮細胞膜分離物（BBMF）的特異性結合實驗證明了敏感蚊幼蟲中腸中晶體毒素蛋白特異性結合位點的存在[6,41,42]。證明二元毒素蛋白同敏感蚊幼蟲的BBMF中的單一類結合位點相結合，但未發現晶體毒素同伊蚊BBMF的特異性結合，這同熒光標記毒素的研究結果相同。晶體毒素的兩組分都能結合到敏感蚊幼蟲的BBMF上，但Scatchard線性分析卻證明只有一種組分能結合到位點上，這同上面提出的二元毒素作用機理假設相符合。結合單獨P42和P51對BBMF的特異性結合實驗結果和其對蚊幼蟲的生物測定結果，一般認為在晶體毒素中，P42決定毒素的殺蚊活性和特異性，P51同蚊幼蟲中腸敏感位點的特異性結合，只有兩種蛋白組分的協同作用才會表現出毒性，晶體毒素是一種二元毒素。 ^[1] 

人們試圖分離出蚊幼中腸上皮的結合位點，但一直未成功，有關結合位點的特性不詳，只證明糖類物質並不能抑制二元毒素同其結合[42]。 ^[1] 

對幾類Mtx毒素的作用機理並未進行詳細研究，只對P100作用機理進行了一些初步研究。敏感蚊幼蟲取食P100蛋白和二元毒素蛋白後的病理變化相差很大，説明兩者存在着完全不同的作用機理。如前所述，P100毒素同Bt的δ-內毒素和其它殺蟲毒素都無同源性，其N-末端存在的假定的轉膜區對其毒性的實現是必需的，而去掉信號肽序列的97kD多肽同樣對蚊幼蟲有毒，説明信號肽是非必需的[30,32]。 ^[1] 

由於P100毒素同百日咳，白喉和霍亂毒素有相同的氨基酸基元（Motif）。而這些毒素都是通過對蛋白質的ADP-核糖基化而發生作用。因此，P100蛋白也可能同ADP-核糖基化有關。在胰蛋酶和蚊幼蟲中腸蛋白酶的作用下，P100蛋白可以降解為27kD的N末端和70kD的C-末端兩個片段。27kD能使庫蚊幼蟲細胞抽提液中的38和42kD蛋白核糖基化；而70kD和97kD（P100缺失N-末端非必需的信號序列）的片段可導致蚊幼蟲細胞系發生明顯的病理學變化，但70kD片段缺少ADP-核糖基酶活性。因此，P100蛋白有兩個功能區：C-末端可導致蚊幼蟲細胞發生病理學變化，N-末端具有ADP-核糖基化活性[33]。 ^[1] 

Mtx2和Mtx3同產氣甲膜桿菌的毒素和綠濃桿菌細胞毒素有同源性，因此認為這兩種Mtx毒素可能同細胞上的微孔形成有關。 ^[1] 

球形芽孢桿菌高毒株產51.4和41.9kDa兩種毒素蛋白，當孢子被蚊幼蟲吞食時毒素蛋白可釋放溶解，引起中腸上皮細胞崩潰，導致幼蟲死亡。由於孢子較快沉澱，球形芽孢桿菌在自然水體中繁殖較差，故用於蚊蟲控制的持效方面不夠理想。利用基因工程的手段，將球形芽孢桿菌的產毒基因克隆，並在藍藻等中表達，是解決球形芽孢桿菌短效的途徑之一^[5,6]。藍藻浮於水面，是一類光合原核生物，廣泛分佈於自然水體，有利於蚊幼特別是按蚊幼蟲吞食。TDR（UNDP/World Bank/WHO，Special Programes for Research and Training in Tropicial Diseases）把這方面的研究作為生物防治的重要內容。山東省寄生蟲病防治研究所在這方面作了一定的工作。他們在實驗室構建轉入含有球形芽孢桿菌蛋白基因穿梭質粒的魚腥藻（pDc26），在9.4×10⁵個細胞/ml濃度以上時，48小時可殺死99%～100%蚊幼蟲，9.13×10⁴個細胞/ml濃度時，4天可殺死99%以上蚊幼蟲。連續觀察2個多月，該基因工程藻仍有明顯殺蚊效果，比單獨使用球形芽孢桿菌滅殺蚊幼有明顯提高，持續時間也延長。 ^[3]