熒光素酶

1990年12月，Promega首次提出螢火蟲螢光素酶(Luc)作為一種新興報告基因技術的應用可能性。當時的人們認為，螢火蟲螢光素酶具備的生物發光特性、極高的靈敏度和快速簡單的檢測流程等特點，可能會對分子生物學家的研究產生重要的影響。幾個月後，第一代螢火蟲螢光素酶報告基因載體和檢測試劑在Promega誕生，使這項新技術正式並更廣泛地為全球研究人員服務。隨後30年裏，Promega不斷在螢光素酶實驗工具領域推陳出新，保持技術領跑者的地位。 這裏提到的螢光素酶即熒光素酶。 ^[1] 

Promega公司推出的第一種螢光素酶檢測試劑Luciferase Assay System（LAR），為靈敏、非放射性的報告基因檢測拉開了序幕。LAR與螢火蟲螢光素酶（luc）報告基因一起，為研究人員開始瞭解基因表達調控因子提供了首要的工具。 ^[1] 

DLR是第一種允許在單個樣本中依次檢測兩個報告基因的試劑。通過允許螢光素酶活性的內部歸一化，在提高報告基因檢測的可靠性方面取得了關鍵進展。此外，pGL3報告基因載體系列具有改良後的螢火蟲螢光素酶基因，luc+。這個改造一種報告基因以實現性能改進的例子後來被進一步應用到pGL4和luc2報告基因上，通過生物信息學和合成方法，實現了更大的改進。 ^[1] 

Promega公司在早期推出的一種重組螢火蟲螢光素酶（Enliten）基礎上，改造出了一種稱為UltraGlo™的熱穩定性螢光素酶。UltraGlo™的開發是在各種檢測和儲藏條件下進行一步法“加樣-讀數”檢測的關鍵。

此後，通過開發新的方法來改變螢火蟲螢光素酶檢測的信號動力學，例如Bright-Glo™、Steady-Glo®和Dual-Glo®允許使用微孔板進行檢測。而“加樣-讀數”的形式簡化了樣品處理，並實現了在非常高通量的應用中使用報告基因檢測。 ^[1] 

隨着UltraGlo™螢光素酶的發展，現在已經實現了“加樣-讀數”的ATP檢測方法。ATP是細胞健康的重要指標，這使得CellTiter-Glo®能有效測定細胞活力，尤其是在高通量應用中。該檢測原理還促進了其它ATP檢測平台的誕生，尤其是用於研究ATP酶（如激酶）的Kinase-Glo®（2004年）和ADP-Glo™（2009年）酶檢測系統。 ^[1] 

除了可以利用螢火蟲螢光素酶反應測定樣品中螢光素酶或ATP的含量外，還可以檢測底物（luciferin）濃度的變化。通過將luciferin與可被不同酶類識別併產生反應的保護基團偶聯，能對這些酶進行靈敏的“加樣-讀數”檢測，如半胱天冬酶（caspase）和其它蛋白酶。 ^[1] 

隨着對螢火蟲螢光素酶化學反應的進一步瞭解以及Promega生物學家和化學家團隊的建立，一種改進的luciferin面世，能更好地用於典型的報告基因檢測應用。這種新的底物——fluoroluciferin，是新型底物開發的一個早期實例。 ^[1] 

基於定向進化和新型底物開發方面的經驗，研究人員從蝦的螢光素酶改造設計出一種新型螢光素酶報告基因，即NanoLuc®螢光素酶。這是一種小分子（19kDa）單體酶，具有獨特的底物，其靈敏度比已具備高靈敏度的螢火蟲或海腎螢光素酶系統高約100倍。這種新型的報告基因有着廣泛的應用前景，為進一步的技術開發奠定了基礎。 ^[1] 

NanoLuc®的小體積和非常明亮的光輸出是作為蛋白質標籤的理想特徵。這些特徵還很適合作為生物發光共振能量轉移（BRET）的供體。一項針對各種能量受體熒光基團的深入研究發現，紅色光譜中的可選擇性有助於消除與BRET測定相關的一些挑戰。可將這些熒光基團添加到蛋白質配基等分子中以測量靶蛋白的結合，或與HaloTag®配基耦聯以進行活細胞中蛋白質：蛋白質相互作用的檢測。 ^[1] 

隨着NanoLuc®的誕生，Promega的科學家努力將該報告基因改造為多亞基系統，即“NanoLuc® Binary Technology”或NanoBiT®。該系統由兩部分組成：11個氨基酸的小標籤和一個更大，更精準的NanoLuc®亞基，LgBiT。這兩部分結構互補結合，重組為一個明亮的螢光素酶。這些亞基的親和力可以和SmBiT肽一樣低，從而可以進行蛋白質相互作用的測定；也可以和HiBiT一樣高，從而允許自我組裝。 ^[1] 

基於NanoBiT®系統的研究，我們將與LgBiT具有極強親和作用的1.3kDa肽段命名為HiBiT。HiBiT作為一種易於檢測且具有高靈敏度的蛋白質標籤，具有多種功能，例如當與基於CRIPSR的標籤一起使用時，可以創建內源性報告基因模型。 ^[1] 

隨着NanoBiT®技術的發展，人們認識到可以利用該系統通過結合免疫測定的組分檢測多種分析物。由此產生的平台（現稱為“Lumit”）提供了具有高靈敏度的簡化免疫檢測法。 ^[1]