熒光素酶報告基因

Luciferase報告基因系統是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統。然後可以通過熒光測定儀也稱化學發光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。是檢測轉錄因子與目的基因啓動子區DNA相互作用的一種檢測方法。

生物體內DNA轉錄成RNA是基因表達的關鍵過程,基因表達調控主要發生在轉錄水平。基因分子生物學研究領域的趨勢之一是逐漸從基因結構和功能分析轉到基因順式作用元件和轉錄因子及其轉錄調控機制上,對基因調控的研究將是今後相當長一段時間內功能基因組學研究的熱點之一。雙熒光素酶報告基因檢測(Dual- Luciferase reporter assay,DR)已成為研究轉錄因子參與基因調控的有效手段,通過對啓動子DNA片段的分析,驗證啓動子結合元件的反式激活能力,探討轉錄因子在信號轉導中的分子機制 ^[1]  。

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啓動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啓動子中的特異順序結合的重要手段。

其原理簡述如下：

（1）構建一個將靶啓動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic等。

（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啓動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。

（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啓動子片段有作用。

（1） 用生物信息學方法分析並預測啓動子區可能的轉錄因子結合位點。

（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啓動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（pGL3-basic）中。

（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆並提純質粒備用。

（4） 擴增轉錄因子質粒，提純備用。同時準備相應的空載質粒對照，提純備用。

（5） 培養293（或其它目的細胞），並接種於24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。

（6） 將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。

（7）提取蛋白並用於熒光素酶檢測。

（8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。

（9） 計算相對熒光強度，並與空載對照比較。

雙熒光素酶報告基因測試∶ 結合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進的共報告基因測試技術在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達時, 通常採用第二個報告基因來減少實驗的變化因素。但傳統的共報告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不夠便利,因為各自的測試化學,處理要求檢測特點存在差異。Promega提供一種先進的雙報告基因技術,結合了螢火蟲熒光素酶測試和海洋腔腸熒光素酶測試。雙熒光素酶報告基因測試系統,結合pRL 載體系統,表達第二個報告基因海洋腔腸熒光素酶,在單管中進行雙熒光素酶報告基因測試,快速,靈敏,簡便。系統還提供 PLB裂解液,用來裂解在多孔板中培養的哺乳細胞,不需操作單個樣品。對於正在使用螢火蟲熒光素酶報告基因載體的研究人員。雙熒光素酶報告基因測試系統將使他們體會到該系統的便利。

體外分泌的熒光素基因：NEB公司提供新型的可在細胞外分泌的熒光素酶,分別是Gluc和Cluc,具體使用幫助可在NEB官方網站找到 ^[1]  。