熒光免疫分析

作為免疫分析法的一種，FIA同樣存在兩種模式，即競爭型和夾心型。其中競爭型（以標記抗原的競爭型為例）的測定原理是基於未標記的抗原（Ag）和標記抗原（Ag-L）競爭結合有限的抗體（Ab）而實現的免疫分析法。檢測時，Ab和Ag-L的濃度是固定的。當未標記的Ag加到Ab和Ag-L的免疫混合物中後，Ag和Ab的結合使得Ag-L與Ab的免疫複合物的量減少。樣品中存在的Ag越多，Ab結合的Ag-L便越少，從Ab-Ag-L免疫複合物的減少或遊離Ag-L的增加，可以定量測定出樣品中待測抗原的含量。其反應過程如下：Ag+Ag-L+Ab≒（Ag：Ab）+（Ag-L：Ab）

對夾心型免疫分析來説，其反應原理是在免疫反應的載體上固定過量的Ab，然後加入一定量的Ag，免疫反應後，再加入過量的標記抗體（Ab-L），以形成“三明治”式夾心免疫複合物。樣品中存在的Ag越多，結合的Ab-L也越多，夾心免疫複合物的標記熒光信號就越強。反應過程如下：Ab+Ag≒Ab：Ag≒Ab：Ag：Ab-L。 ^[2] 

蛋白質芯片作為生物芯片的一種，已經成為研究蛋白質的重要工具。蛋白芯片的檢測原理同免疫檢測，也可以稱為芯片免疫分析。蛋白芯片大致分為三種類型，第一類是由蛋白質微陣列構成的芯片，第二類是以各種微結構為基礎的微流控型芯片，第三類是結合微球編碼和流式檢測的懸浮芯片。這三種類型中，利用免疫原理並採用熒光檢測的居於主流，因此，此類蛋白芯片技術可以稱作芯片上的熒光免疫分析，由於具有樣品量少，分析通量高，能進行多組分同時分析等優點，已經成為熒光免疫分析乃至整個免疫分析的重要發展方向。

這三種類型的蛋白芯片技術中，微陣列型免疫芯片發展最早，但直接沿用基因芯片的熒光標記方法，靈敏度不高。因為在基因芯片中，標記的靶序列cDNA可以滲入大量熒光分子，而獲得很高的檢測靈敏度。但蛋白芯片只能採用抗體直接標記的形式，一個抗體分子上能標記的熒光分子數受到很大限制。因此目前微陣列型免疫芯片發展緩慢。 ^[3] 

微流控免疫芯片是在20世紀90年代出現的芯片集成毛細管電泳技術基礎上發展起來的，隨後微流控芯片技術在很多領域得到了迅速發展。這一被稱為“芯片上實驗室”的微分析系統具有高效性、設計容易、用樣量少、可以進行批量分析以及小型化和自動化等特點。儘管這一技術仍處於初步發展階段，但它已經推動傳統的分析化學發生着一場革命性的變化。報道很多，如Koutny等報道的芯片毛細管電泳熒光免疫分析皮質甾醇、Chiem等報道的芯片分離熒光免疫分析血清中茶鹼等；Yang等建立了基於脂類雙層膜的芯片熒光免疫分析；Bernard報道了一種微鑲嵌免疫芯片；Linder等用生物素和親和素修飾聚二甲基硅烷（PDMS）芯片，改善了芯片的親水性；Dodge等用蛋白A修飾玻璃芯片上的微通道，建立了電動力學驅動的熒光免疫分析法。Rubina建立了三維凝膠固定蛋白質的夾心型系列毒素定量免疫分析法。 ^[4] 

懸浮芯片系採用熒光編碼微球結合流式細胞檢測技術建立起來的一種多組分同時檢測技術，該系統以不同熒光比例的高分子微球作為免疫分析的固相，流式細胞儀可以識別所有這些微球。不同的抗體的標記在特定熒光比例的微球上，和樣品中的抗原反應後，再與熒光標記抗體結合，熒光標記抗體上的熒光標記物採用同一種，但與高分子微球中的熒光檢測通道有別。這樣，利用流式細胞儀器分別計數不同高分子微球上的熒光標記抗體的熒光強度，就可以定量檢測樣品中抗原的濃度。懸浮芯片的突出優點是具有多組分同時檢測能力，很好的重現性，分析通量高。編碼微球的數目已經達到100種，亦即將能用於100種抗原的同時檢測。雖然實際樣品並不需要那麼多組分的同時分析，但可見其發展潛力。懸浮芯片的發展體現在兩個方面，一是隨着蛋白質組學和抗體庫技術的完善，人們有望對更多的細胞組分進行同時測定，另外，採用新的染料編碼技術有可能實現更多微球的編碼。 ^[5]