激光捕獲顯微切割

機體組織包含有上百種不同的細胞，這些細胞各自與周圍的細胞、基質、血管、腺體、炎症細胞或免疫細胞相互粘附。在正常或發育中的組織器官內，細胞內信號、相鄰細胞的信號以及體液刺激作用於特定的細胞，使這些細胞表達不同的基因並且發生複雜的分子變化。在病理狀態下，如果同一類型的細胞發生了相同的分子改變，則這種分子改變對於疾病的發生可能起着關鍵性的作用。然而，發生相同分子改變的細胞可能只佔組織總體積的很小一部分；同時，研究的目標細胞往往被其它組織成分所環繞。為了對疾病發生過程中的組織損害進行分子水平分析，分離出純淨的目標細胞就顯得非常必要。1996年，美國國立衞生院（NIH）國家腫瘤研究所的[2]開發出激光捕獲顯微切割技術（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美國Arcturus Engineering公司成功研製激光捕獲顯微切割系統，並實現商品化銷售。應用該技術可以在顯微鏡直視下快速、準確獲取所需的單一細胞亞羣，甚至單個細胞，從而成功解決了組織中細胞異質性問題。這項技術現已成為美國“腫瘤基因組解剖計劃”的一項支撐技術 ^[1]  。

LCM的基本原理是通過一低能紅外激光脈衝激活熱塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峯接近紅外激光波長），在直視下選擇性地將目標細胞或組織碎片粘到該膜上 ^[2]  。LCM 系統包括倒置顯微鏡、固態紅外激光二極管、激光控制裝置、控制顯微鏡載物台（固定載玻片）的操縱桿、電耦合相機及彩色顯示器。用於捕獲目標細胞的熱塑膜直徑通常為6mm，覆在透明的塑料帽上，後者恰與後繼實驗所用的標準 0.5ml離心管相匹配。

機械臂懸掛控制覆有熱塑膜的塑料帽，放到脱水組織切片上的目標部位。顯微鏡直視下選擇目標細胞，發射激光脈衝，瞬間升温使 )EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜滲透到切片上極微小的組織間隙中，並在幾毫秒內迅速凝固。組織與膜的粘合力超過了其與載玻片間的粘合力，從而可以選擇性地轉移目標細胞。激光脈衝通常持續0.5~5.0毫秒，並且可在整個塑料帽表面進行多次重複，從而可以迅速分離大量的目標細胞。將塑料帽蓋在裝有緩衝液的離心管上，將所選擇的細胞轉移至離心管中，從而可以分離出感興趣的分子進行實驗 ^[3]  。

EVA膜約100~200μm厚，能夠吸收激光產生的絕大部分能量，在瞬間將激光束照射區域的温度提高到90°C，保持數毫秒後又迅速冷卻，保證了生物大分子不受損害。採用低能量紅外激光的同時也可避免損傷性光化學反應的發生。

LCM最顯著的優點在於其迅速、準確和多用途的特性。結合組織結構特點以及所需的切割精確度，通過選擇激光束的直徑大小，可以迅速獲取大量的目標細胞。LCM與以顯微操作儀為基礎的顯微切割技術相比 ^[4]  ，具有以下優點：(1)分離細胞速度快，無需精巧的操作技能；(2)捕獲細胞和剩餘組織的形態學特徵均保持完好，可以較好地控制捕獲細胞的特異性；(2) 捕獲細胞與塑料帽結合緊密，減少了組織損失的風險。相比而言，除了激光切割彈射微分離系統 ^[5]  以經染色的用於存檔的切片也可被成功進行顯微切割。

儘管 LCM 應用廣泛，但對於常規染色、固定且不加蓋玻片的組織切片，其視覺分辨率受到很大限制。而對於那些本身缺乏一定結構特點的複雜組織（如淋巴組織，廣泛浸潤的腺癌等），要準確分離出某一類細胞幾乎是不可能的。Fend等 ^[6]  通過採用特殊染色，尤其是免疫組化方法，使目標細胞或想要去除的細胞變得更加醒目，從而解決了上述難題。

應用 LCM，偶爾會出現無法將選擇的細胞從切片上移走的情況，出現這種結果有兩種原因：(1) 細胞與熱塑膜之間的粘合力不足，通常是由於組織未完全脱水或激光的能量設置過低造成的；(2)組織切片與載玻片間的粘合力過強，通常發生在顯微切割乾燥時間過長的冰凍切片。針對不同樣本組織（包括免疫組化染色的組織切片），一些研究小組分別詳盡報道了採用適合的處理方法，以達到最佳的顯微切割條件 ^[7]  。

LCM較以往的顯微切割技術有了突破性的進展，現已廣泛應用於腫瘤研究，包括前列腺癌 ^[8]  、腎癌、肺癌、甲狀腺癌 ^[9]  、食管癌 、胃癌、肝癌、膽管癌、結腸癌 、乳腺癌、膠質瘤 、惡性胸膜間皮瘤、淋巴瘤、卵巢癌等。此外，LCM還成功應用於其它一些疾病的研究中，如Crohn病 ^[10]  、肌萎縮性側索硬化症 ^[11]  、子宮內膜異位症、獲得性免疫缺陷綜合徵、結核病、丙型肝炎等。而應用LCM所分離的組織也多種多樣，包括單個細胞、單一細胞羣（主要是癌巢）、血管等類型。

LCM成功解決了組織異質性問題，且具有迅速、準確等諸多優點，已被廣泛應用於腫瘤等疾病基因水平的研究中，並顯示出了良好的應用前景 ^[1]  。但今後可能還需要以下幾個主要方面的發展和完善：理論上，除上述組織及細胞以外，LCM還可應用於其他所有組織細胞（如脾臟巨噬細胞、肝臟Kuffer細胞等）的分離，但其各自的切片製備、染色等技術方法尚需要進行探索；開發相應的應用程序，僅需輸入目標細胞或組織的特異性參數即可實現計算機自動控制LCM ^[12]  ，從而大大縮減所需的人力和時間；提高捕獲單個細胞的精確度，以減少非目標組織的沾染；進一步優化快速免疫組化染色的步驟，改進DNA和 RNA抽提技術，實現從少量捕獲細胞或組織中獲得高質量的核酸。