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溶菌酶
鎖定
溶菌酶(lysozyme)又稱胞壁質酶(muramidase)或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一種能水解細菌中黏多糖的鹼性酶。溶菌酶主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1,4糖苷鍵,使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。溶菌酶還可與帶負電荷的病毒蛋白直接結合,與DNA、RNA、脱輔基蛋白形成複合體,使病毒失活。
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該酶廣泛存在於人體多種組織中,鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的淚、唾液、血漿、乳汁等液體,以及微生物也含此酶,其中以蛋清含量最為豐富。
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其中根據其來源的不同,可以將其分為四類,分別是植物溶菌酶、動物溶菌酶、微生物溶菌酶以及蛋清溶菌酶。
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溶菌酶簡介
中文名稱:溶菌酶
分子結構圖:
溶菌酶理化性質
溶菌酶純品呈白色、微黃或黃色的結晶體或無定形粉末,無異味,微甜,易溶於水,不溶於丙酮、乙醚。溶菌酶遇鹼易被破壞,但在酸性環境下,溶菌酶對熱的穩定性很強,在pH值為4-7時,100℃處理1min,仍能較好地保持活力:pH值為3時,能耐100℃加熱處理45min。
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溶菌酶化學性質非常穩定,當pH值在一定範圍內劇烈變化時,其結構幾乎不變。溶菌酶不可逆變性的臨界點是77℃,隨溶劑的變化,不可逆變性臨界點也發生變化,當溶菌酶所處溶液pH值小於1時,不可逆變性臨界點降低到43℃。
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溶菌酶抑菌機理
溶菌酶能有效地水解細菌細胞壁的肽聚糖,其水解位點是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子間的β-1.4糖苷鍵。肽聚糖是細菌細胞壁的主要成份,它是由NAM、NAG和肽“尾”(由4個氨基酸殘基)組成,NAM與NAG通過β-1.4糖苷鍵相連,肽“尾”則是通過D-乳酰羧基連在NAM的第3位碳原子上,肽尾之間通過肽“橋”(肽鍵或少數幾個氨基酸)連接,NAM、NAG、肽“尾”與肽“橋”共同組成了肽聚糖的多層網狀結構,作為細胞壁的骨架,上述結構中的任何化學鍵斷裂,皆能導致細菌細胞壁的損傷。對於革蘭氏陽性菌(G+),如藤黃微球菌、枯草桿菌或溶壁微球菌等,與革蘭氏陰性菌(G-),如大腸桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、肺炎桿菌等,其細胞壁中肽聚糖含量不同,G+細菌細胞壁幾乎全部由肽聚糖組成,而G-細菌只有內壁層為肽聚糖,因此,溶菌酶對於破壞G+細菌的細胞壁較G-細菌強。
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溶菌酶製備方法
溶菌酶親和層析法
親和層析法是利用蛋白質和酶的生物學特異性,即蛋白質或酶與其配體之間所具有的專一性親和力而設計的色譜技術。酶一底物複合物形成之後,在一定的條件下分離複合物便得到純淨的酶。常常使用的吸附劑為幾丁質及其衍生物,如:幾丁質粉、羧甲基幾丁質、幾丁質包埋纖維素、脱氨幾丁質粉、N-酰化殼聚糖、脱氨再生幾丁質凝膠。
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溶菌酶離子交換樹脂法
離子交換法是利用離子交換劑與溶液中的離子之間所生的交換反應來進行分離的,分離的效果較好,廣泛用於微量組分的富集。一般流程為:鮮蛋一預處理一攪拌吸附一上柱洗脱一等電點沉澱一透析一噴霧乾燥一成品。
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溶菌酶在等電點以下較廣泛的pH值範圍內,分子帶正電荷,可吸附於弱酸性陽離子交換樹脂上,洗脱後鹽析,可得溶菌酶沉澱,再進行精製可得成品。蛋清吸附724樹脂,洗滌緩衝液洗脱,硫酸銨溶液鹽析透析,用NaOH去鹼性蛋白,凍幹溶菌酶,凍乾粉沉澱乾燥得到溶菌酶。在5—10℃下,將新鮮蛋清540kg加入到已處理好的80kg 724樹脂中,攪拌吸附6h,在0—5℃靜置過夜。傾出上層蛋清,樹脂離心甩幹,用蒸餾水反覆洗去黏附的卵蛋白,然後將樹脂裝入柱內,用0.15mol/L、pH=6.5磷酸緩衝溶液約150L洗滌樹脂,再用約600L的10%硫酸銨溶液洗脱,收集洗脱液。洗脱液中加硫酸銨,使最終含硫酸銨量為40%,有白色沉澱生成,冷處放置過夜。虹吸上層清液,沉澱吸濾抽乾,再用1倍蒸餾水溶解沉澱呈稀糊狀,然後裝入透析袋,在約5℃的條件下,對蒸餾水透析24h左右,中間換水2—3次。離心去除沉澱,沉澱再用少量水洗一次,洗液與離心液合併。再往透析清液中慢慢加入1mol/L氫氧化鈉溶液,同時不斷攪拌,使pH值上升到8.0—9.0,如有白色沉澱,即離心除去。然後用3mol/L鹽酸調pH=5.0,冷凍乾燥,即得白色片狀溶菌酶。也可將離心液用3mol/L鹽酸調pH=3.5,在攪拌下緩慢加入5%的固體氯化鈉,在約5℃的温度下靜置48h,離心,沉澱用0℃丙酮洗滌,乾燥,即得溶菌酶。
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溶菌酶食鹽直接結晶法
在蛋清中加入一定量的碘化物或碳酸鹽等鹽類,並調pH值至9.5—10.0,溶菌酶會以結晶形式慢慢析出,而大多數蛋白質仍然在溶液。在超濾濃縮脱鹽後,為獲得較純產品,採用結晶純化酶液經超濾處理後,用NaOH調整pH 9.5,離心去除。上清液在緩緩攪拌下,加NaCl至5%,靜置一週,得粗結晶。結晶溶於pH 4.6醋酸水中,分去不溶物後,進行重結晶,結晶的最終得率為60%左右。即每公斤蛋清中可得重結晶品近1.3 g,活力測定為8000U/mg。
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溶菌酶聚丙烯酸沉澱法
聚丙烯酸沉澱法為將提取過濾後含酶洗脱液,首先經過吸附步驟,即將過濾後的澄清溶液用20%的NaOH溶液調pH至6.0,在調pH值的過程中不停的攪拌。有少量的乳白色沉澱析出,然後加入15%聚丙烯酸,立即有白色沉澱析出,加至pH值為3.0為止,靜置17個小時進行靜析,得到粘附於底部的乳白色膠狀物。第二步解離,將前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸餾水並用0.5 mol/L的碳酸鈉,將其溶解,轉移後,將pH值調到9.5。加入5%CaCl2溶液將溶菌酶聚丙烯酸解離,至無沉澱析出,然後過濾,得到澄清溶液。第三步鹽析,將所得澄清溶液加入5%的NaCI溶液攪拌均勻。放入冰箱調温度為0℃。待有晶體析出後,用無水乙醇洗滌數次,置恆温培養箱中40℃條件下乾燥稱重。
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溶菌酶儲存方法
溶菌酶應用領域
溶菌酶醫學領域
副作用
溶菌酶食品領域
它對革蘭氏陽性菌、喜氧性孢子形成菌、枯草桿菌、地衣型芽孢桿菌等都有抗菌作用,而對沒有細胞壁的人體細胞不會產生不利影響。因此,適合於各種食品的防腐。
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另外,該酶還能殺死腸道腐敗球菌,增加腸道抗感染力,同時還能促進嬰兒腸道雙歧乳酸桿菌增殖,促進乳酪蛋白凝乳利於消化,所以又是嬰兒食品、飲料的良好添加劑。
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溶菌酶生物工程領域
溶菌酶專性水解細菌細胞壁的特點,有助於瞭解細菌細胞壁的構造:將細胞壁分解後製備成的原生質體,可用於微生物分類以及微生物育種等學術研究。近年來,溶菌酶已成為細胞工程和基因工程必不可少的工具酶,用來提取和製造酶、核酸和活性多肽等。
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溶菌酶尿溶菌酶
溶菌酶原理
溶菌酶來自單核細胞、中性粒細胞,是一種能溶解某些細菌的酶類。可酵解革蘭氏陽性球菌壁上的乙酰氨基多糖成分,使細胞壁破裂。其分子量為14000—15000Da,可從腎小球基底膜濾出,90%以上可被腎小管重吸收,所以尿液中很少或無溶菌酶。用一種細菌懸液作為基質,加入待測標本後保温一定時間,如標本中含溶菌酶,則細菌被溶解,細菌懸液濁度下降或變清,可用光電比濁法測其濁度變化,或用平皿法測定其溶菌圈的大小。
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- 參考資料
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