氧化硫硫桿菌

細菌冶金是濕法冶金新的研究領域和方向,目前已在銅、鈾、金的提取方面獲得了成功應用。幾乎所有的硫化礦都可用細菌提取其中的有價金屬。且細菌冶金技術因其投資小、成本低、能耗少、工藝流程簡單和對環境友好等特點,已成為21 世紀資源處理的主要工藝技術. 目前使用較多的浸礦菌種除氧化亞鐵硫桿菌( Thiobacillus ferro2oxidans, T. f) 外還有氧化硫硫桿菌( Thiobacillusth iooxidans, T. t). 氧化硫硫桿菌是一種化能自養菌,專性好氧,嗜酸,革蘭氏染色陰性,呈桿狀,寬0. 3～0. 5μm,長1. 0～2. 0μm. 氧化硫硫桿菌以氧化單質硫或還原態的硫化物來獲得自身細胞生長和代謝所需要的能量,以NH+4 為氮源,以空氣中CO2 為碳源。 因為生長環境的差異,不同地域的氧化硫硫桿菌之間必然存在着差異,因此,須根據不同的浸礦要求分離不同的氧化硫硫桿菌菌株. 本文就是根據某礦浸礦的要求,去分離、純化和培養一株氧化硫硫桿菌菌株 ^[1]  。

1　水樣採集

水樣取自某礦礦坑。取樣方法如下:先將用牛皮紙紮好的取樣瓶與取樣勺用高壓滅菌器高壓滅菌,在取樣點打開牛皮紙,用酒精燈燒灼瓶口,舀取水樣至取樣瓶三分之二處,迅速紮好牛皮紙帶回。

2　培養基的配製

液體培養基採用Starky - Na2 S2O3 培養基和Waksman 培養基。 固體培養基採用Starky -Na2 S2O3 - 瓊脂培養基。

3　水樣處理

考慮到水樣的pH值在2. 5 左右,適合氧化硫硫桿菌的生長,細菌數目較多,所以將水樣倍比稀釋1 000倍。

4　細菌分離

取稀釋後的水樣10 mL加入到90 mL Starky- Na2 S2O3 培養基中,置恆温水浴搖牀培養,温度設定為30℃,轉速設定為200 r /min。待菌液pH值達到1. 0左右時,取5 mL菌液加入到95 mL新的培養基中。如此反覆進行5次。

5　細菌純化

在事先用紫外線滅菌的潔淨操作工作台中,取10μL培養好的菌液加入到固體培養基上,再用滅菌的塗菌器將菌液塗布均勻。將培養皿正置室温2 h後轉到30℃恆温培養箱中倒置培養。

6　單克隆挑選與培養

用滅菌的10 μL tip 頭從培養皿表面挑取形態規則,大小適中的單個菌落轉到液體培養基中,置30℃水浴搖牀中培養。轉速設置為200 r /min。待菌液pH值達到1. 0左右時,取5 mL菌液加入到95 mL 新的培養基中(同時接種到Starky -Na2 S2O3 培養基和Waksman培養基中)。如此反覆進行5次。最後一次培養時,每天測定pH值,當pH值達到1. 0左右時用血球計數板計數細菌量 ^[2]  。

1　細菌分離

培養時每天測定pH值,到第7天時pH值達到了1. 0. 染色後鏡檢發現視野下有較多行動活躍的桿菌。

2　細菌純化

培養進行到第12天可以看到培養皿上有針尖大小的菌落,到第20天可以看到菌落直徑長至1 mm左右,呈綠色。

3　克隆挑選

挑選單克隆轉到液體培養基中培養,每天測pH值,其中pH值變化最快的一株菌株變化情況使用血球計數板計數,氧化硫硫桿菌的數量都達到了每毫升107 個。

關於能在礦坑水和礦體土壤中生存的細菌已有不少的報道。目前用人工合成培養基已經分離培養了許多新菌種,這些新菌種被推廣和應用到生產過程中,產生了巨大的經濟效益和社會效益。

用於礦物浸出的微生物多為化能自養菌,在繁殖和生長過程中,不要求任何有機物,純粹靠無機物為能量來源。 對於某些細菌,比如氧化亞鐵硫桿菌,一些有機物的存在還會抑制其生長。 這些浸礦細菌有着一些共同的特點:它們能在普通微生物所不能生存的強酸性礦坑水中生存,革蘭氏染色為陰性,活動能力較強,通過直接作用和間接作用浸出礦石。

氧化硫硫桿菌作為浸礦細菌的一種,生長過程中也不需要有機物,它能通過對硫及其化合物的氧化獲得生長和繁殖必須的能量。同時,在這個過程中會產生硫酸和能溶於酸性介質的金屬元素,達到加快浸礦速度,減少酸耗,從而降低生產成本的作用。並且,它在對貧礦和尾礦的處理上有其獨特的優勢。 所以,選育生長能力強,氧化性能好的氧化硫硫桿菌具有重要的意義。

本研究中我們使用了Starky - Na2 S2O3 培養基和Waksman培養基,研究發現,氧化硫硫桿菌在使用Na2 S2O3 做能源時, pH值呈現先升高後降低的趨勢,我們認為這是因為在氧化硫硫桿菌生長的初期,它在溶液中發生緩慢的歧化反應,生成亞硫酸鈉和硫單質,這兩者都是氧化硫硫桿菌極易利用的還原性物質。同時,硫代硫酸鈉和亞硫酸鈉的水解釋放出OH- ,使溶液的pH緩慢上升。在經過7天的遲緩期,隨着氧化硫硫桿菌進入對數生長期,才開始發揮其對硫和還原性含硫化合物的卓著的氧化作用能力而開始產生大量硫酸,使pH值大幅下降。 此過程可以用以下反應式表示:2S + 3O2 + 2H2O→2H2 SO4

而使用硫做底物時, pH值先是緩慢下降7天左右,然後開始迅速下降. 我們認為主要是培養初期細菌數量較少,當生長7天后,細菌進入對數生長期,細菌數量迅速增加,產生的硫酸相應增多,引起pH值迅速降低. 所以這兩種培養基都可以用於氧化硫硫桿菌的培養,但是如果使用氧化硫硫桿菌浸礦時,由於它在Waksman培養基中生長時,沒有pH值上升的過程, pH值下降更迅速,更有利於浸礦反應 ^[3]  。