微電泳法

五、或七管微電極，一般每管尖端直徑約1μm，七管總直徑5-8μm.。若充灌的 是小分子物質，如NMDA、Glu等，則每管尖端直徑可以是0.5μm, 七管總和為3-4μm，這樣可使記錄管電阻高達5MΩ-10MΩ，周邊管達40MΩ-100MΩ，不僅能滿足電泳要求，還能記錄到較大的電位。若充灌的是大分子肽類，則直徑要大一些，一般不能超過10μm，否則易致泄漏，且電痊記錄過小。但本法雖然解離量與電流成正比，但不同的微電極或不同的物質的實際釋出量有很大差異，且無規律可循。應將微電泳與整體功能結合起來，才能得出正確的結論。

微電極充灌一般多為較高濃度的NaCl (4mol)或KCl (3mol)以使電極尖端獲得高離子濃度，從而得到低阻抗微電極。其中一個周邊管充以150mmol/L NaCl作平衡電流用，其餘根據需要充不同灌注液。充灌方法有許多種，壓力法，充灌注，真空法，酒精法等，最常用的是玻璃纖維法。

（1）濃度：增加傳導性並減少噪聲，可用較高濃度的溶液，以使所要電泳的離子具有較高的濃度和穩定形式一般微電泳溶液濃度為5-500mmol/L不必過大。對於效能很強的化學物質，可用150mmol/L的NaCl作為溶劑，溶液濃度儘量低，以防止因藥物擴散引起的生物學效應。

（2）pH值：常用低濃度（0.1N）鹽酸或NaOH將溶劑調整到適當的pH值，以增加溶質的溶解度和穩定度。但有些物質，如中性氨基酸難以離子化。此時可參考其pKa值調整，使pH=pKa-1，這可使90%氨基酸離子化。根據經驗，一般pH為3.5-4.0。完全不能離了化物質可用微壓力法注射。另外，充灌注一定要乾淨，避免污染。

（3）防止藥物漏出，可通過持續施加一個帶極性的“遲滯電流”來防止。遲滯電流的極性方向與所要電泳的離子所帶電荷相反，這樣使得所要電泳的離子向回移動（對抗漏出），從而使尖端離子濃度降低，一般電流大小應根據實際情況具體調整，一般為10-30nA。有些效能很強的物質則需施加較大的遲滯電流。

（4）注射電流。其大小和持續時間以能產生預期的生物學效應為標準。注射電流的極性方向與遲滯電流方向相反，即和甩要電泳的離子所帶電荷相同。

一般大多微電泳儀均能進行自動電流平衡，一般不會產生偽跡，但手工操作時應注意。

如果所要電泳的藥物的溶解度和離子化程度低，則其傳導性也低，而傳導性越低，就越易產生較高的電噪聲。

在較高電噪聲下，即使維持穩定的注射電流，但其對離子的泳出率也往往大大偏離理論值，可採用下列方法克服：儘可能選用尖端大的電極，可達10μm左右；將該物質充灌於周邊多個周邊管中，實施電泳時分別是以較小的注射電流同時從幾個管內將藥物排 出，這樣可減少噪聲，如果所要電泳的藥物的溶解度和離子化程度較高，則噪聲一般不成問題。

許多情況下，電泳某藥物觀察其生物學效應時需要重複幾次並且給一個固定劑量。

由於遲滯電流的存在，使得電極尖端的藥物濃度降低，所以一開始後的即早期，所排出的藥物較少，隨後逐漸上升至一個平台。這取決於注射電流的大小和開始電泳時電極尖端離子濃度的高低。

因此重複給藥時，應該以固定程序進行：固定大小的注射電流、固定的注射時間（應足以使藥物釋出和反應達到平台值）、固定間隔時間等，達到相對定量的目的。