- 中文名
- 引物
- 外文名
- primer
- 类 型
- RNA引物、DNA引物
- 引物长度
- 18-27 bp，不大于38
- GC 含量
- 一般为 40-60%
- Tm 值
- 在 72℃左右
- 作 用
- DNA复制
- 见载刊物
- 《生物化学与分子生物学名词》 科学出版社
- 公布时间
- 2008年 [4]
类型
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引物设计
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引物设计PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用 ∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplexformation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。 [2]
最佳区域
长度
引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm=4(G+C)+2(A+T)，在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearestneighbor method)
选择T
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
碱基随机分布
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
自身避免互补
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol，∆G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性 [3]），否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
5′ 端中间G值应较高3′ 端较低
△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
5′ 端可以修饰
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
单链无二级结构
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
自由能
∆G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3’端 ∆G 值较低（绝对值不超过 9），而 5’端和中间 ∆G 值相对较高的引物。引物的 3’端的 ∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。
特异性
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
设计要求
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●Tm=58-60度。
●GC=30-75%。
●3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的全部物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
设计软件
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■Oligo 6
Oligo 6● 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列；
●为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现；
●分析和评价用其他途径设计的引物是否合理；
Primer Premier 5.0
