已表達序列標誌

首先從樣品組織中提取mRNA ,在逆轉錄酶的作用下用oligo ( dT) 作為引物進行RT -PCR 合成cDNA ,再選擇合適的載體構建cDNA 文庫,對各菌株加以整理,將每一個菌株的插入片段根據載體多克隆位點設計引物進行兩端一次性自動化測序,這就是EST 序列的產生過程。

EST作為表達基因所在區域的分子標籤因編碼DNA 序列高度保守而具有自身的特殊性質,與來自非表達序列的標記(如AFLP、RAPD、SSR 等) 相比更可能穿越家系與種的限制,因此EST標記在親緣關係較遠的物種間比較基因組連鎖圖和比較質量性狀信息是特別有用。同樣,對於一個DNA 序列缺乏的目標物種,來源於其他物種的EST也能用於該物種有益基因的遺傳作圖,加速物種間相關信息的迅速轉化。具體説,EST的作用表現在:

(1) 用於構建基因組的遺傳圖譜與物理圖譜;

(2) 作為探針用於放射性雜交;

(3) 用於定位克隆;

(4) 藉以尋找新的基因;

(5) 作為分子標記;

(6) 用於研究生物羣體多態性;

(7) 用於研究基因的功能;

(8) 有助於藥物的開發、品種的改良;

(9) 促進基因芯片的發展等方面。

正是因為EST 表現出了這些巨大潛能,使其得到了充分的利用與發展。

人類基因組研究中，有一個區別於“全基因組戰略”的“cDNA戰略”，既只測定轉錄的DNA序列，也就是測定基因轉錄產物mRNA反轉錄產生的互補DNA---cDNA.cDNA代表了基因中編碼蛋白質的序列。EST則是cDNA的一個片段，一般長200-400個核苷酸對。一個全長的cDNA分子可以有許多個EST，但特定的EST有時可以代表某個特定的cDNA分子。兩端有重疊的共有序列的EST可以組裝成一個疊連羣(contig),直到裝配成全長的cDNA序列，這樣就等於是克隆了一個基因的編碼序列。將EST定位在基因組，也可作為基因組作圖時的一種標記序列。