巢式PCR

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通 PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內部）結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短於第一次擴增。巢式PCR的好處在於，如果第一次擴增產生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對並擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。

巢式PCR通過兩輪PCR反應，使用兩套引物擴增特異性的DNA片段。第二對引物的功能是特異性的擴增位於首輪PCR產物內的一段DNA片段。

第一步：目標的DNA模板藍色的第一對引物結合。第一對引物也可能結合到其他具有相似結合位點的片段上並擴增多種產物。但只有一種產物是目的片段（圖中未顯示可能的多種產物）。

第二步：使用圖中紅色標記的第二套引物對第一輪PCR擴增的產物進行第二輪PCR擴增。

由於第二套引物位於第一輪PCR產物內部，而非目的片段包含兩套引物結合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片段。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。

一般應用於動物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。

在RACE(rapid-amplification of cDNA ends)中，也利用巢式PCR增加特異性。

在Illumina公司平台的第二代高通量測序中，也應用類似巢式PCR的原理，進行目的片段的擴增。

如圖，首先在目的片段通過TA克隆，引入一個片段，然後在特定的一個Flow Cell固定大量的特異探針，通過PCR反應的特異性，擴增目的片段，然後繼續應用於下一步測序

巢式PCR，可以在10的六次方基因組背景下檢測到一個拷貝的病毒基因，也不像二次PCR容易產生成片的產物，是效果最好的PCR，擴增質量最高的PCR。使用兩套引物擴增特異性的DNA片段。第二對引物的功能是特異性的擴增位於首輪PCR產物內的一段DNA片段。 第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增。從而提高反應的特異性。

右圖為巢式PCR反應模式圖：