多連體

若干個結構相同的單體，按同一方向首尾相連構成的一個DNA長分子，即是一個線狀多連體。λ噬菌體在其生長週期的某一階段，能以“滾環"方式複製出很長的線性多連體。

多連體DNA，在粘性質粒或λ噬菌體中構建的重組體，進行體外包裝反應時，在高濃度的DNA及連接酶條件下所形成的多連體。

在λ噬菌體感染的早期，環形的λ DNA分子按θ形式從雙向進行復制，其複製的起點是位於cⅡ基因和O基因之間，並且需要O和P這兩個基因編碼的蛋白質分子的積極參與。到了感染的晚期，控制滾環複製機理的開關被啓動了，合成出了由一系列線性排列的λ基因組DNA組成的長多連體分子。滾環複製機理的開關是受λ噬菌體gam基因產物控制的，它可以抑制大腸桿菌核酸外切酶V對複製中的DNA分子的作用(這種酶是由大腸桿菌recB和recC基因編碼的，所以又叫做RecBC酶)。因此，在RecBC^-的寄主細胞中，gam^-的噬菌體只能產生出多連體的DNA分子。因為在噬菌體顆粒的包裝成熟過程中，需要由λ噬菌體基因組DNA組成的多體分子參加；而在RecBC^-寄主細胞中，gam^-噬菌體只能產生出λ噬菌體基因組DNA的單體分子。因此在這種情況下，噬菌體顆粒成熟之前就要發生單體分子之間的重組作用。這種重組作用，是由噬菌體的red基因產物，或是寄主細胞的recA基因產物的作用所引起的。但無論是重組作用形成的，還是由滾環複製產生的λ噬菌體基因組DNA的多連體分子，都必須經過核酸酶的切割作用，從cos位點處將它分離成單位長度的單體分子之後，才能夠被包裝起來。已知有四種頭部蛋白質參與了這種切割過程 ^[1]  。

DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一。

連接的方法有：

(1)粘性末端連接

DNA片段兩端的互補鹼基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。

(2)平頭末端連接

用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高。

(3)同聚寡核苷酸末端連接。

(4)人工接頭分子連接

在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內切酶識別位點的寡核苷酸片段，經限制性內切酶作用後，就會產生粘性末端。

連接反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質粒為載體時，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質粒為載體時，形成環狀分子，比率常為1:1 ^[2]  。

DNA體外重組是將目的基因(外源DNA片段)用DNA連接酶在體外連接到合適的載體DNA上，這種重新組合的DNA稱為重組DNA。

DNA體外重組技術，主要是依賴於限制酶和DNA連接酶的作用。在選擇外源DNA同載體分子連接反應的程序時，一般需要考慮下列三個因素：①實驗步驟要儘可能簡單易行；②連接形成的接點序列，應能被某種限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；③對轉錄和轉譯過程中密碼結構的閲讀應不發生干擾。

在連接反應中，正確地調整載體DNA和外源DNA之間的比例，是獲得高產量的重組體轉化子的一個重要因素。如果是使用質粒分子作為克隆的載體，其重組體分子是由一個載體分子和一個目的DNA片段連接環化而成的，故當載體DNA與目的DNA的比值為1時，便有利於這類重組體分子的形成；若是應用λ噬菌體或黏粒做載體時，配製高比值的載體DNA/給體DNA的連接反應體系，則有利於重組體分子的形成。以黏粒載體為例，因為只有當給體DNA片段的兩個末端都同黏粒載體結合之後，才能被有效地包裝。在體外連接反應中，DNA的總濃度對形成什麼樣的DNA分子類型同樣也會有所影響。一般規律是，低濃度的DNA分子問的相互作用機會少，有利於環化作用；而高濃度的DNA，則有利於形成長的多連體DNA分子。此外，連接反應的温度也是影響連接效果的另一個重要因素 ^[3]  。