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報道基因
鎖定
報道基因(reporter gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因,從而在其表達後,使細胞表現出特定的可檢測性狀。
- 中文名
- 報道基因
- 外文名
- reporter gene
- 定 義
- 是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因,從而在其表達後,使細胞表現出特定的可檢測性狀
報道基因 | 作用方式 | 優點 | 缺點 |
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氯黴素乙酰基轉移酶(CAT;細菌) | CAT通過使乙酰基與抗生素共價連接的方式來解除氯黴素的毒性,報道基因實驗通常檢測n-丁酰基的一半從輔助因子n-丁酰輔酶A轉移到具有放射活性的氯黴素上,被修飾的氯黴素的遷移率發生改變,並且能夠摻入有機溶劑。 | 沒有內源活性;可使用自動化的ELISA。 | 需添加底物;需破損樣品;線性範圍窄,只有三個數量級;不靈活;使用放射性同位素;可用非放射性檢測,但敏感性差。 |
分泌型鹼性磷酸酶(SEAP;源於人胎盤的修飾酶) | 通常使用顯色底物磷酸對硝基苯酯(pNPP)進行檢測;而目前多被更敏感的化學發光底物,如1,2-二噁二酮CSPD取代。 | 分泌型蛋白;允許在不同時間重複檢測同一樣品;可用便宜的比色法和高度敏感的熒光試驗進行檢測。 | 在某些細胞中有內源性的活動;干擾測試的化合物的篩選。 |
螢光素酶(lux;細菌) | 細菌性螢光素酶(luxAB)能夠催化還原型核黃素磷酸(FMNH2)與長鏈脂肪醛的氧化,發出藍綠色的光(波長為490nm)。將LuxAB基因與待測基因偶聯,再加入長鏈醛基底物後,可檢測發出的熒光。另外,若將全部的lux操縱子(luxCDABE)與啓動子融合,則可為檢測啓動子的活動提供內源底物。 | 在融合了整個操縱子(luxCDABE)後則不需要底物;敏感性非常高;原位無損傷監測;許多細胞中無內源性活性;更適合於檢測與分析原核基因的轉錄。 | 需氧;不耐熱;含醛基的底物有毒;產生的光子不能對單細胞進行監測;比luc的線性範圍窄;半衰期短;不適用於哺乳動物細胞;代謝成本高。 |
β-半乳糖苷酶(β-gal;細菌) | β-Gal能夠催化β-半乳糖苷的水解反應,例如,乳糖可水解為兩個單體。此報道基因的檢測方法依賴於使用的底物,可使用顯色法(例如,o-硝基苯基-β-D-半乳糖苷或ONPG),組化方法(例如,5-溴化-4-氯代-3-吲哚-β-D-半乳糖苷或X-Gal),熒光測定方法(例如,4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷或MUG),化學發光法(例如,含1,2-二氧化物的底物),或電化學法(例如,p-氨基-β-D-半乳糖苷或PAPG)。 | 良好的特性與穩定性;多樣化的讀出過程;能在厭氧環境下發揮功能。 | 需添加底物;有擴散性——需要將靶細胞進行隔離並使其通透化;在哺乳動物細胞內的活性可能會干擾測定結果。 |
螢光素酶(螢火蟲的) | 催化螢光素酶的氧化,產生可被熒光光度計檢測的光。 | 高特異性;無內源性活性;動態範圍廣(7~8個數量級);無損傷,儘可能原位監測;價格比lux便宜;分析簡便;可從多種生物中獲取不同種類的螢光素酶。 | 需要底物(螢光素)、氧氣供應和ATP。 |
綠色熒光蛋白(GFP;水母)(自發熒光蛋白) | GFP作為輔助蛋白先吸收由初級發光蛋白aequorin釋放的波長為470nm的藍光,後釋放波長為570nm的綠光。許多GFP衍生物和其他改變了光譜性質的自發熒光蛋白,在相應的激發波長的光線下,通過對樣本曝光來發揮報道蛋白的功能。 | 自發熒光(無需底物);無內源性活性;存在光譜特性變化的突變體;存在熱穩定的突變體;較高的光穩定性;在現有光學系統下,原位無損傷可視化觀察。 |
- 參考資料
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- 1. 基於細胞模型的高通量藥物篩選 .中國知網.2008-06-15[引用日期2012-12-27]
- 2. (美)M.R.格林,J.薩姆布魯克主編;賀福初主譯. 分子克隆實驗指南 下 原書第4版[M]. 北京:科學出版社, 2017.
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