基因工程學

《基因工程學》全書共12章，除第1章緒論外，其餘各章主要闡述基因、工具酶、載體、重組DNA分子的轉化與重組子篩選、核酸的分離純化與目的基因的克隆、大腸桿菌基因工程、酵母菌基因工程、基因組、蛋白質工程、途徑工程和合成生物學等內容。

本書的特色：①以實際操作為抓手，詳細論述了基因工程的各個環節以及實驗注意事項和實例；②重點講述了以大腸桿菌為代表的原核微生物和以酵母菌為代表的真核微生物的基因工程技術；③基因組這一章節，詳細講述了三代DNA測序和多種基因組定點編輯(同源重組、RecET/Red重組系統、ZFN、TALEN和CRISPR-Cas系統)的原理，還介紹了與基因組學相關的自然科學和人文科學知識；④以蛋白質工程的實際應用為目標，介紹了基因改造的理性分子設計理論；⑤在講述途徑工程基本原理的基礎上，以全新的角度論述了其在實際工作中的應用實例；⑥簡要介紹合成生物學，以利於工程菌的準確管控。 ^[1] 

第1章緒論 / 1

1.1基因工程的基本概念1

1.2基因工程的核心理論和核心技術2

1.2.1基因工程所依賴的核心理論2

1.2.2基因工程所依賴的核心技術2

1.3基因工程的建立與發展2

1.3.1基因工程的建立2

1.3.2基因工程的發展3

1.4基因工程的產業化及應用7

1.4.1基因工程的產業化7

1.4.2基因工程的應用7

1.5轉基因生物的安全性與倫理10

1.5.1轉基因生物的安全性10

1.5.2轉基因生物的倫理12

1.6應用實例13

1.6.1問題的提出13

1.6.2生化產品生產中存在的問題13

1.6.3基因工程的用途13

1.6.4實例14

第2章基因 / 15

2.1孟德爾“遺傳因子”:生物性狀遺傳的符號15

2.2基因:位於染色體上的遺傳功能單位15

2.2.1等位基因16

2.2.2復等位基因17

2.3順反子:一個基因一條多肽18

2.4操縱子:遺傳信息傳遞和表達的統一體20

2.5超基因21

2.6假基因22

2.7斷裂基因23

2.7.1RNA剪接24

2.7.2內含子類型26

2.8重疊基因29

2.9可動基因30

2.9.1Ac-Ds系統31

2.9.2插入序列31

2.9.3轉座子33

2.9.4P因子37

2.9.5反轉錄轉座子38

2.10癌基因和抑癌基因38

2.11染色體外基因39

2.11.1質粒39

2.11.2線粒體基因40

2.11.3葉綠體基因42

2.11.4非孟德爾遺傳42

第3章工具酶 / 44

3.1限制性內切核酸酶44

3.1.1宿主的限制和修飾現象45

3.1.2限制性內切核酸酶的類型45

3.1.3限制性內切核酸酶的命名49

3.1.4影響限制性內切核酸酶活性的因素50

3.1.5限制性內切核酸酶對DNA的消化作用52

3.1.6限制性內切核酸酶反應的終止53

3.1.7限制性內切核酸酶酶切反應的操作步驟和注意事項53

3.2DNA聚合酶54

3.2.1DNA聚合酶Ⅰ（E.coli）54

3.2.2大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段56

3.2.3T4 DNA聚合酶57

3.2.4依賴RNA的DNA聚合酶57

3.2.5T7 DNA聚合酶57

3.2.6修飾的T7 DNA聚合酶58

3.3DNA連接酶58

3.3.1大腸桿菌和T4噬菌體的DNA連接酶58

3.3.2影響連接反應的因素59

3.3.3DNA片段在體內和體外的連接——黏性末端的連接60

3.3.4平末端的連接61

3.3.5連接反應的注意事項64

3.4DNA及RNA的修飾酶64

3.4.1末端脱氧核苷酸轉移酶64

3.4.2T4多核苷酸激酶65

3.4.3鹼性磷酸酶66

3.5外切核酸酶66

3.5.1外切核酸酶Ⅶ66

3.5.2外切核酸酶Ⅲ67

3.5.3λ外切核酸酶和T7基因6外切核酸酶68 ^[1] 

3.6單鏈內切核酸酶68

3.6.1S1核酸酶68

3.6.2Bal31核酸酶69

3.7細胞裂解酶70

3.7.1溶菌酶70

3.7.2蛋白酶K70

3.7.3纖維素酶70

3.7.4其他裂解酶71

3.8其他71

3.8.1瓊脂糖酶71

3.8.2核酸酶抑制劑71

第4章載體 / 72

4.1質粒載體72

4.1.1質粒的一般生物學特性73

4.1.2質粒載體的選擇76

4.1.3常用的大腸桿菌質粒載體78

4.2噬菌體載體86

4.2.1單鏈噬菌體載體86

4.2.2雙鏈噬菌體載體90

4.3黏粒載體95

4.3.1黏粒載體的組成96

4.3.2黏粒載體的特點96

4.3.3黏粒載體的應用96

4.4噬菌粒載體97

4.4.1噬菌粒載體的概念97

4.4.2pUC118和pUC119噬菌粒載體98

4.4.3pBluescript噬菌粒載體98

4.5人工染色體載體100

4.5.1酵母人工染色體載體100

4.5.2細菌人工染色體載體101

4.5.3P1人工染色體載體103

第5章重組DNA分子的轉化與重組子篩選 / 104

5.1DNA分子的轉化與擴增104

5.1.1DNA重組轉化的基本概念104

5.1.2受體細胞的選擇105

5.1.3轉化方法107

5.1.4轉化率及影響因素110

5.1.5轉化細胞的擴增111

5.1.6進行轉化時的注意事項112

5.2重組體克隆的篩選與鑑定112

5.2.1遺傳檢測法112

5.2.2物理檢測法116

5.2.3核酸雜交法119

5.2.4PCR檢測法122

5.2.5克隆基因定位法122

5.2.6測序檢測法124

5.2.7外源基因表達產物檢測法125

第6章核酸的分離純化與目的基因的克隆 / 128

6.1核酸的分離純化128

6.1.1核酸分離提取的原則128

6.1.2核酸的分離提取129

6.1.3質粒DNA的提取132

6.1.4RNA的提取133

6.1.5核酸的檢測134

6.2目的基因的克隆136

6.2.1鳥槍法137

6.2.2cDNA法139

6.2.3PCR擴增法143

6.2.4化學合成法153

6.2.5基因文庫的構建156

第7章大腸桿菌基因工程 / 159

7.1外源基因在大腸桿菌高效表達的原理159

7.1.1啓動子159

7.1.2終止子165

7.1.3核糖體結合位點165

7.1.4密碼子166

7.1.5質粒拷貝數168

7.2大腸桿菌工程菌的構建策略169

7.2.1包涵體型異源蛋白的表達170

7.2.2分泌型異源蛋白的表達174

7.2.3融合型異源蛋白的表達175

7.2.4寡聚型異源蛋白的表達179

7.2.5整合型異源蛋白的表達182

7.2.6蛋白酶抗性或缺陷型表達系統的構建183

7.3重組異源蛋白的體外復性活化185

7.3.1蛋白質變性的動力學原理185

7.3.2摺疊中間狀態分子的聚結作用186

7.3.3包涵體的溶解與變性187

7.3.4異源蛋白的復性與重摺疊189

7.4基因工程菌的遺傳不穩定性及其對策195

7.4.1基因工程菌遺傳不穩定性的表現與機制195

7.4.2改善基因工程菌不穩定性的策略196

7.5大腸桿菌基因工程的案例198

第8章酵母菌基因工程 / 203

8.1酵母菌的宿主系統203

8.1.1提高重組蛋白表達產率的突變宿主菌203

8.1.2抑制超糖基化作用的突變宿主菌204

8.1.3減少泛素依賴型蛋白降解作用的突變宿主菌205

8.1.4內源性蛋白酶缺陷型的突變宿主菌206

8.2酵母菌的載體系統206

8.2.1釀酒酵母的2μ環狀質粒206

8.2.2乳酸克魯維酵母的線型質粒208

8.2.3果蠅克魯維酵母的環狀質粒208 ^[1] 

8.2.4含ARS的YRp和YEp209

8.2.5含CEN的YCp210

8.2.6穿梭載體211

8.3酵母菌的轉化系統212

8.3.1酵母菌的轉化程序212

8.3.2轉化質粒在酵母細胞中的命運213

8.3.3用於轉化子篩選的標記基因214

8.4酵母菌的表達系統216

8.4.1酵母菌啓動子的基本特徵與選擇216

8.4.2酵母菌啓動子的可調控表達系統217

8.4.3外源基因在酵母菌中表達的限制因素219

8.4.4酵母菌表達系統的選擇220

8.5酵母菌基因工程的案例222

第9章基因組 / 225

9.1基因組測序225

9.1.1DNA測序方法225

9.1.2基因組序列測定234

9.1.3序列組裝236

9.2功能基因組學240

9.2.1組學簡介241

9.2.2轉錄物組241

9.2.3蛋白質組242

9.2.4基因組學發展的趨勢243

9.2.5基因組學應用244

9.2.6基因組倫理學246

9.3基因組表觀遺傳248

9.3.1表觀遺傳248

9.3.2位置效應249

9.3.3DNA甲基化250

9.3.4染色體重建250

9.4基因組編輯251

9.4.1遺傳重組252

9.4.2基因敲除257

9.4.3新一代的基因組定點編輯技術261

第10章蛋白質工程 / 275

10.1蛋白質工程的基本概念275

10.1.1蛋白質工程的基本特徵275

10.1.2蛋白質工程的研究內容和應用276

10.1.3蛋白質工程實施的必要條件276

10.2實際工作中的蛋白質工程277

10.2.1基因的體外定向突變277

10.2.2基因的體外定向進化277

10.2.3突變文庫的篩選模型278

10.2.4蛋白質工程的設計思想278

10.2.5蛋白質基因改造的理性分子設計279

第11章途徑工程 / 287

11.1途徑工程的基本概念287

11.1.1途徑工程的基本定義287

11.1.2途徑工程的基本過程288

11.1.3途徑工程的基本原理290

11.2途徑工程的研究策略291

11.2.1在現存途徑中提高目標產物的代謝流292

11.2.2在現存途徑中改變物質流的性質293

11.2.3利用已有途徑構建新的代謝旁路294

11.3途徑工程的應用實例294

11.3.1明串珠菌發酵產甘露醇294

11.3.2乳酸乳球菌發酵產甘露醇297

11.3.3在木質纖維素生物煉製中的應用297

11.3.4細胞性能的改進298

第12章合成生物學 / 301

12.1概述301

12.2合成生物學概念302

12.3合成生物學研究的核心內容304

12.3.1生物成分標準模塊化設計和構建305

12.3.2中心法則再設計和構建306

12.3.3生物網絡的設計和構建308

12.3.4底盤基因組的設計和構建312

12.3.5基因組合成313

12.4合成生物學的研究策略和方法314

12.4.1合成策略和方法315

12.4.2分析策略和方法321

12.5合成生物學的應用研究323

12.5.1設計和構建新的生物大分子323

12.5.2設計和構建新的途徑/網絡324

12.5.3合成傳感器325

12.5.4合成生物學用於藥物發現、生產和治療327

12.5.5合成生物學用於控制代謝流量328

12.5.6工程細胞329

12.5.7合成生態系統330

12.6設計與構建新的遺傳系統331

12.7合成生物學面臨的問題和挑戰332

12.7.1表徵、標準化和模塊化332

12.7.2噪聲的處理332

12.7.3表觀遺傳332

12.7.4計算工具332

12.7.5程序化抽提333

12.7.6合成生物學結果的處理333

12.7.7部件不相容問題333

12.8社會及倫理問題333

12.9小結334

附錄 / 335

附錄一遺傳命名指南335

附錄二常見的克隆方法341

附錄三實驗過程中的注意事項342

附錄四實驗室成員的基本素質與行為準則346

附錄五提取高質量RNA的技巧349

參考文獻 / 352 ^[1]