埃博拉疫苗

2014-2015年西非埃博拉疫情期間，中國工程院院士陳薇率隊赴非洲疫區完成埃博拉疫苗臨牀試驗，是第一個在境外開展臨牀研究的中國疫苗 ^[2]  ，而後成為全球首個新基因型埃博拉疫苗 ^[3]  。2014年11月26日，美國國家衞生研究院(NIH)宣佈，美國製埃博拉疫苗已成功通過臨牀試驗，接受疫苗的志願者均產生了抗體，且未出現嚴重副作用 ^[1]  。2016年12月23日，世界衞生組織宣佈，由加拿大公共衞生局研發的疫苗可實現高效防護埃博拉病毒。這是世界上第一種可預防埃博拉出血熱的疫苗，有望於2018年上市。這一疫苗通過了世衞組織領導的臨牀試驗，近1.2萬直接或間接接觸過埃博拉患者的人蔘與了試驗。

埃博拉病毒2013年開始在西非多國蔓延， 2014年9月28日，據世界衞生組織統計，超過6200人受到埃博拉病毒感染，死亡人數超過2900人。自2014年3月以來, 埃博拉病毒在西非多個國家暴發,引起全球關注,WHO已將此疫情列為國際關注的突發公共衞生事件。雖然有很多因素限制了埃博拉疫苗的發展,目前無可用於人的疫苗獲批上市,但當前的嚴峻形式促進了疫苗的研究。

重組水泡性口膜炎病毒VSV的表面有一個糖蛋白，作用是識別宿主細胞。這個蛋白就相當於一把鑰匙，打開人體細胞那把鎖之後，就可長驅直入了。

研究者對這種病毒進行了轉基因，把它原有的糖蛋白用埃博拉病毒表面的糖蛋白替換。這樣一來，改造之後的VSV疫苗既能讓機體產生針對埃博拉病毒的抗體，同時又沒有致病性。

目前缺乏有效治療手段，因此，研製有效預防和控制埃博拉病毒（EBOV）暴發的疫苗極為迫切。在過去20年裏，有多種疫苗被研發，且在不同動物模型中研究其有效性，每種疫苗均有其獨特的優點和限制性。

4.1 滅活疫苗 在早期研究中，將EBOV通過福爾馬林滅活或熱滅活後，滅活的EBOV不能對非人靈長類提供保護。此外，通過碘萘基疊氮化物滅活病毒，可保護機體免遭致死性病毒的攻擊，但如果使用γ射線滅活，就不會達到同樣的保護效果，説明滅活方法可能會影響病毒蛋白的結構和免疫原性。雖然滅活疫苗可避免預存免疫和載體本身誘導的免疫反應問題，但須在4級生物安全實驗室中操作活病毒，成本高，且面臨安全性等問題，限制了此類疫苗的發展。

4.2 複製子疫苗 委內瑞拉馬腦炎病毒（Venezue－ lan equine encephalitis virus, VEEV） 複製子表達 EBOV糖蛋白（GP）或核蛋白（NP）後，被用於埃博拉疫苗的研究。 單獨免疫表達NP的VEEV複製子可對小鼠提供完 全保護，單獨免疫表達 GP 的 VEEV 複製子可對豚 鼠提供完全保護，將二者聯合免疫，既可保護小鼠， 又可保護豚鼠。但不論是單獨免疫還是聯合免疫， 即使免疫劑量為 107 病灶形成單位（focus-forming units, FFU）也不能保護短尾猴。當免疫劑量達到 1010 FFU 時，才可保護非人靈長類。需高劑量免疫和預存免疫限制了此疫苗在人類中的應用。 庫京病毒，為黃病毒家族的一員，具有自我複製 RNA 能力，以此病毒為基礎製備的複製子疫苗可保護25%至86%的豚鼠。此疫苗未在非人靈長類中進行評價，且雖然VEEV 複製子疫苗對豚鼠提供 100%保護，但需要高劑量才能保護非人靈長類，因 此庫京病毒複製子疫苗的前景不被看好。

4.3 DNA 疫苗 已研究的DNA 疫苗被證明可保護小鼠和豚鼠免遭致死性 EBOV 的攻擊，且可多次反覆注射以增強免疫反應。已有 DNA 疫苗用 於Ⅰ期臨牀試驗，證明其安全並有免疫原性。然而，尚未在非人靈長類模型中評價 DNA疫苗的效果。

4.4 亞單位疫苗 利用桿狀病毒表達系統，在昆蟲細胞內生產EBOV GP蛋白並純化後，免疫豚鼠1次， 或在免疫 DNA 疫苗後作為加強免疫，可誘導產生較高水平的抗體，但不能保護機體免遭病毒的攻 擊，且保護率與中和抗體水平間無對應關係。

病毒樣顆粒（virus-like particles, VLPs）以其獨 特特點吸引研究者關注：可對免疫個體進行多次免 疫；由於 VLPs 空間結構與天然病毒相似，因此誘導中和抗體的能力比可溶性抗原更強；VLPs 易被抗 原提呈細胞（如樹突狀細胞）捕獲，從而刺激機體產生抗體和細胞免疫反應；可將免疫刺激分子融合表 達於 VLPs 中，用以增強免疫反應。最早的研究 是將表達 GP 和 VP40 蛋白的 DNA 載體轉染人293T 細胞後獲得 EBOV VLPs，3 次免疫後，可保護小鼠。如果在 VLPs 中加入佐劑， 2 次免疫小鼠即可抵抗高劑量病毒的攻擊，免疫 1 次就可保護豚鼠， 還可保護非人靈長類，首次證明非病毒載體疫苗在非人靈長類模型中可激發保護性免疫反應。此外，也可利用昆蟲細胞生產 VLPs，其形態和功能均與在哺乳動物中生產的相似，可在小鼠體內激發有效的保護反應。使用昆蟲細胞生產提高了產量，大幅度降低了生產成本，且昆蟲細胞更安全，但須在非人靈長類模型中驗證其有效性。

4.5 複製缺陷型 EBOV 利用反向遺傳技術，可 對 EBOV 基因組進行改造。通過將轉錄激活物額外病毒結構蛋白（VP30）的基因去除，獲得沒有複製能力的 EBOV （rEBOVΔVP30）。將 rEBOVΔVP30 接種可穩定表達 VP30 的細胞系後，病毒可感染細胞產生子代病毒， 但由於基因組缺少 VP30，因此子代病毒無感染能力， 即生命週期為單週期。但由於 rEBOVΔVP30 基 因組仍含有95%的 EBOV 基因組，因此對其安全性有疑慮，尤其擔心在病毒傳代過程中，是否會重組 VP30 用以完善自身的基因組。然而實驗表明，連續傳代至少7代以內，沒有發現重組現象，並且以目 前對絲狀病毒的瞭解，此重組現象理論上不會發生。

4.6.1 重組 5 型腺病毒（adenovirus type 5, Ad5）疫苗 重組Ad5疫苗是最早被研究的重組活載體疫苗，也可能是 EDV 疫苗平台中最為領先的疫苗， 被證明在非人靈長類中可提供有效保護。早期研究 中，對非人靈長類首次免疫可表達 EBOV GP的DNA 疫苗，再加強免疫可表達 GP 的人 Ad5疫苗， 可保護機體免遭致死性 EBOV 的攻擊，首次證明了通過免疫可保護非人靈長類。隨後實驗表明，將表達 GP和NP蛋白的重組 Ad5 混合，對非人靈長類免疫1次即可提供保護。後續實驗進一步證明， 單獨免疫表達 GP 的重組Ad5，最低免疫劑量為 1010 噬斑形成單位即可對非人靈長類提供足夠的保護。然而，由於腺病毒的預存或抗載體免疫，限制了此疫苗的發展。如果研製非注射用疫苗（如口服 或滴鼻免疫）或非人類病毒載體疫苗，可能會給 Ad5 載體疫苗帶來希望。對此，一種新型鼻部噴霧疫苗已被研製，該疫苗使用弱化的重組 Ad5 表達 EBOV GP 蛋白，對非人靈長類免疫後 62d能提供部分保護（67%），免疫後 150 d體內仍存在針對 GP 蛋白的 T 細胞羣和抗體。下一步將進行Ⅰ期臨牀試 驗來檢測這種疫苗在人類中的效果。該疫苗可刺激機體產生抗 GP 的抗體和特異性 T 細胞反應，並可對機體提供100%的保護。

4.6.2 重組水泡型口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）疫苗 通過反向遺傳操作，將 EBOV GP蛋白替換VSV的G蛋白獲得的重組VSV，免疫1次， 即可保護小鼠、豚鼠和非人靈長類免遭病毒的攻擊。在非人靈長類感染病毒後，此疫苗也可保護 機體，説明其有暴露後預防治療的可能性。

4.6.3 重組狂犬病病毒（rabies virus, RABV）疫苗 將表達 GP 的重組 RABV 免疫 1次可保護部分小鼠， 免疫2次可保護100%的非人靈長類。儘管重組 RABV疫苗效果比重組 VSV 低，但將表達GP 的重組 RABV 滅活後，可部分保護非人靈長類，提示可考慮 將此類疫苗以滅活形式應用，這樣對人類更為安全。

4.6.4 重組副粘病毒疫苗 除了以彈狀病毒（例如 VSV 和 RABV）為載體外，以重組副粘病毒為載體 也被用於 EDV 疫苗研發。單獨表達 EBOV GP 蛋白 或同時表達 GP 和 NP 蛋白的重組人副流感病毒 3 型（human parainfluenza virus 3, HPIV3）免疫 1 次， 可對豚鼠提供保護。但在非人靈長類中，須免疫 2 次才可提供完全保護。在人羣中有針對 HPIV3 的免 疫，為了避免預存免疫干擾疫苗免疫原性，通過去 除 HPIV3 表面糖蛋白 F和 HN 蛋白（預存免疫抗 體針對的靶標位點）的基因，製備新型重組病毒，雖複製能力下降，但免疫1次即可保護豚鼠。以新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）為載體也用於疫苗研發，首次免疫時使用重組 NDV，加強免疫 時使用重組HPIV3，在非人靈長類中可引起良好免疫反應。然而，此種疫苗在非人靈長類中的保護性未有報道。將一種新病毒引入人類中應用是此類疫苗主要擔心的問題。

4.6.5 重組鉅細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）疫苗 表達EBOV NP蛋白T細胞表位的重組 CMV 疫苗免疫小鼠後可保護小鼠免受病毒攻擊。但靈長類 動物體內存在CMV，且CMV有高度的宿主特異性。因 此，進一步研究時，須考慮其有效性和安全性問題。

4.6.6 重組牛痘病毒（vaccinia virus, VV）疫苗 表達 EBOV 蛋白的重組 VV 也可誘導機體產生保護性免疫反應。表達 EBOV GP蛋白的重組 VV 疫苗可對豚鼠提供保護，但不能保護非人靈長類，説明此疫苗還有缺陷。

如重組水泡口腔炎病毒(VSV)疫苗，其表面有一個糖蛋白，作用是識別宿主細胞。這個蛋白就相當於一把鑰匙，打開人體細胞那把鎖之後，就可長驅直入了。研究者對這種病毒進行了轉基因，把它原有的糖蛋白用埃博拉病毒表面的糖蛋白替換。改造之後的VSV疫苗既能讓機體產生針對埃博拉病毒的抗體，同時又沒有致病性。

病毒載體與埃博拉病毒保護性抗原GP蛋白重組的疫苗等在靈長類動物中以誘導有效的免疫應答走在前面,而且已完成Ⅰ期臨牀研究,有效解決了應急需求,但它們均以活病毒為載體,存在潛在的安全性風險,距離正式批准上市仍有一段路要走。

2.病毒樣顆粒疫苗(Virus-like particles,VLP)

是一類具有病毒結構,沒有病毒複製能力,較減毒疫苗和以病毒為載體的疫苗更加安全的疫苗種類。以病毒樣顆粒形成的疫苗抗原可有效激發免疫應答和免疫保護效果,研發病毒樣顆粒疫苗已成為埃博拉疫苗發展的重要方向。

埃博拉病毒已被列為生物安全等級4級的病毒,應用埃博拉病原體的操作受到嚴格的限制和規定。因此阻礙了疫苗研發及其致病機制研究。【5】且世界上擁有這種級別實驗室的國家和地區本來就不多，故開展研究的難度比較大，以至於人們對於埃博拉了解得還不夠深刻。常用的疫苗策略有減毒活疫苗和滅活疫苗，這兩種策略在埃博拉病毒上都不適用，減毒活疫苗一旦出現病毒毒力回覆，後果不堪設想，而滅活疫苗更是不可取，因為生產這種疫苗首先需要獲得大量的埃博拉病毒，生產這麼多病毒需要與四級生物安全同級別的工廠，而且培養這麼大量的埃博拉病毒本身就是一件非常危險的事情。【1】

目前處於Ⅰ期臨牀階段的埃博拉疫苗與現上市疫苗一樣,多為有針肌肉注射免疫,存在恐針感、交叉感染、斷針等弊端,抗原用量大、免疫保護不全面現實問題。由此,在免疫接種策略上降低抗原用量、誘發全面免疫應答與保護及無針無痛、簡便快速、安全高效已成為疫苗研發迫切解決的重大科學問題。

【1】 環球網2014年11月27日 《美國宣佈首個埃博拉疫苗通過臨牀試驗，安全有效》

【2】 上海醫藥 2017年 第38卷 第1期

【3】金宏麗；王化磊；鄭學星；楊松濤；夏鹹柱； 《埃博拉病毒病疫苗研究進展》

【4】李康；周喆《抗埃博拉病毒疫苗和核酸類藥物研究進展》

【5】 《重組埃博拉VLP疫苗製備及免疫效果初步研究》 寧夏醫科大學；任天宇 2015