單分子技術

原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy，AFM） ^[1]  是由IBM公司的Binning與斯坦福大學的Quate於1985年發明的，其目的是為了使非導體也可以採用掃描探針顯微鏡（SPM） ^[2]  進行觀測。原子力顯微鏡通過探針與被測樣品之間的微弱的相互作用力( 原子間力) 來獲得物質表面的形貌。原子力顯微鏡將探針裝在一彈性微懸臂的一端, 微懸臂的另一端固定, 當探針在樣品表面掃描時, 探針與樣品表面原子間的排斥力會使得微懸臂輕微變形, 當一束激光經微懸臂的背面反射到光電檢測器,可以精確測量微懸臂的微小變形, 這樣就實現了通過檢測樣品與探針之間的原子排斥力來反映樣品表面形貌和其他表面結構。

光鑷技術( Optical tweezers) ^[3]  是Ashkin 等在20 年前發明的, 它的原理是利用激光動量轉移產生的輻射壓力, 從而形成具有梯度力場的光學陷阱, 處在陷阱中的微粒受到梯度力場的作用,就被鉗住。這個光學陷阱像是一把小鑷子, 因此被稱為光鑷。如果在小球上連結上生物大分子, 並且把小球 鉗住在光學陷阱中, 可以在溶液環境中對生物大分子進行操作。光鑷是測量和控制生物大分子的有力工具。用這種技術可以測量出生物大分子間微弱的力( 皮牛頓量級) 以及生物大分子的很小位移(納米量級)。

單分子光譜技術( single-molecule spectroscopy, SMS) ^[4]  是將熒光基團標記在生物大分子上, 標記在生物大分子上的熒光基團發生各種特性變化, 通過光譜分析等就能夠得到有關分子間相互作用、酶活性、反應動力學、構象動力學、分子運動自由度以及在化學和靜電環境下活性改變的信息。

單分子操作技術已經越來越多地應用到核酸研究 ^[5]  當中, 並且取得了重要的進展。這些研究包括: DNA 的打開與修飾、DNA 凝聚、蛋白質-DNA 相互作用、複製和轉錄等。

核酸單分子操作研究起始於 1992 年 Smith 等對單個 DNA 分子的彈性測量。實驗裝置如圖 1 所示, 一段雙鏈 DNA 分子的一端連接到玻璃表面上, 另一端連接到磁性小球上。DNA 分子連接到不同固體表面是通過生物素-鏈黴抗生物素蛋白、地高辛免疫的特異反應來實現的, 這類方法至今仍是這個領域的常用方法。整個體系的組裝在溶液中完成, 在外加磁力的作用下, DNA 被拉伸, 藉助於顯微鏡, 就能測量到小球的位移。這樣, 就可以得到在不同鹽濃度緩衝液中的單個 DNA 多聚體( 48502 個鹼基對) 的力-延伸曲線, 並且在這個實驗中力最大隻增加到10 皮牛頓。在作用力很小的體系中, 雙鏈 DNA 的彈性是由熵的競爭所控制, 熵的競爭導致DNA 分子螺旋, 而外部作用力則拉伸 DNA 分子。在力-延伸曲線中可觀測到一重要偏離, 而這與高聚物彈性自由連接鏈模型( the freely jointed chain model ofpolymer elasticity) 預測相一致, 表明DNA 在溶液中有重要的局部彎曲。在蠕蟲樣鏈模型( the wormlikechain model) 中, DNA 分子是一個熱量變動誘導延伸的彈性管子, 它能提供雙鏈 DNA 在微力作用下彈性變化較好的理論解釋。

與DNA、蛋白質-DNA 相互作用有關的酶學 ^[6]  過程也能利用單分子操作技術進行研究, 如用一個解鏈的實驗裝置來研究 DNA-蛋白質的相互作用( 實驗裝置如圖2 所示) , 酶結合到雙鏈DNA上可以短暫地阻止 DNA 雙鏈開口叉(the opening fork) 移動。一旦開口叉移動到結合蛋白的位置，力將會增加直到積聚到足夠的彈性能量移去蛋白。因此, 蛋白誘導的序列依賴的力信號峯的出現就給出了酶結合到 DNA 上的位置, 而峯值就提供了蛋白質-DNA 複合物穩定性的相關信息。應用這種方法, Bockelmann 等研究了DNA 和EcoRV 限制性內切酶之間的相互作用。Koch 等不僅測量蛋白誘導的力信號峯隨不同速度的變化, 而且還比較不同蛋白質-DNA 複合物的穩定性( DNA 與 BsoBI、Xho I、EcoRI 核酸內切酶的相互作用) 。

單分子操作技術具有直接可測性。十年來, 基於核酸單分子操作的研究給我們提供了大量信息, 而這些信息原來是很難甚至不能通過經典的分子生物學方法來得到的。未來的工作包括進一步改進單分子操作的實驗技術, 特別是精確度、分子體系控制程度、表面連接方法等。另外, 探索與其它實驗技術的聯合應用,如對 RecBCD 解螺旋酶解螺旋 DNA 的單分子研究, 研究者們聯合使用了微流體技術、光鑷技術、單分子熒光技術。另一方面, 實驗設計還需要進一步改善, 以利於探索新的發現, 如Michelle 等最近利用單分子熒光光譜技術研究核酶的斷裂與連接反應。王鵬業等利用分子梳( molecular combing) 的方法結合單分子熒光光譜技術, 觀測到 DNA 的60% 的過度拉伸, 並且觀測到了單個 DNA 分子的力誘導熔解現象。單分子操作技術方興未艾 ^[7]  , 把這項技術應用到有創意的實驗中去, 有可能帶來意想不到的實驗結果。