反相液相色譜

在分配色譜中，組分在色譜柱上的保留程度，取決於它們在固定相和流動相之間的分配係數，組分在固定相上的保留時間越長，固定相與流動相之間的極性差值越大。而流動相為極性，固定相為非極性的液相色譜就是反相液相色譜。

反相色譜法是以表面非極性載體為固定相，以比固定相極性強的溶劑為流動相的一種液相色譜分離模式．反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團，基於樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離．在生物大分子分離中，多采用離子強度較低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、異內醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作流動相．普通的反相色譜固定相和孔徑大於300Å的硅膠鍵合烷基固定相應用較為普遍，聚合物基質的反相色譜固定相也有較多應用．

反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大，對於非極性化合物通常遵循以下規則：(弱)非鍵合硅膠 ＜＜ 氰基 ＜ C1(TMS) ＜ C3 ＜ C4 ＜ 苯基 ＜ C8 ≈ C18(強)．溶質保留值與固定相表面積成正比，普通載體(80Å)的表面積約為250m2/g，而300Å孔徑載體的比表面積約為60m2/g。當其他條件相同時，溶質在300Å孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80Å孔徑色譜柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利於強親水性樣品洗脱．樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調整，溶劑強度取決於有機溶劑的性質和其在流動相中的濃度．在反相色譜中，採用高溶劑強度、低極性的流動相時可獲得較低保留值．固定相的不同也可以導致選擇性發生變化，氰基、苯基、C8、C18等柱的選擇性有很大差異，一般應優先考慮C8、C18柱，然後是氰基柱，再次是苯基柱．

反相條件下，大多數蛋白質由於低PH、有機溶劑存在、温度高於室温和疏水鍵合相等綜合原因發生變性，這些化合物可能以兩種或兩種以上獨立或動態平衡的形式存在，它們通過色譜柱的保留速度不同，導致譜峯展寬、變形、甚至出現單一蛋白有多個峯的現象，部分變性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脱蛋白的回收率低和鬼峯．反相色譜固定相表面烷基鏈長度對蛋白質的反相保留和蛋白質的活性回收有很大差異，烷基鏈越長(C8、C22、C30)，固定相疏水性越強，為使蛋白質等生物分子洗脱，流動相合機溶劑的含量較高，疏水性過強，會導致生物分子的不可逆吸附和生物活性損失，因此短鏈烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分離中表現出優勢。對多數小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色譜柱分離，使蛋白完全展開並避免聚集或沉澱，能夠得到理想的分離結果．

在低pH流動相條件下進行分離，如0.1% TFA適合於大多數樣品，10~25mmol/L磷酸對疏水性強的蛋白質更有利；以乙腈作有機溶劑，丙醇可能對疏水性強的蛋白質有利；柱温50~80℃；將樣品溶於6mol/L尿素或鹽酸胍中(只可在室温)進行預處理；用疏水性更強的鍵合相(長鏈與短鏈烷基鍵合相)；加兩性表面活件劑分離大分子和疏水性強的蛋白質等實驗條件有利於蛋白質樣品完全變性或儘可能降低變性。