去磷酸化作用

探討阿爾茨海默病(AD)腦損傷逆轉的可能性及其途徑。

用去磷酸化和免疫印跡法研究AD腦損傷可逆性。

蛋白磷酸酯酶(PP)-2A和PP-2B可使AD神經原纖維纏結中的II型雙螺旋絲（PHFII-tau）在Ser-199/Ser-202去磷酸化，Ser-396/Ser-404部分去磷酸化;此外，PP-2A和PP-2B可分別使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化;去磷酸化後PHFII-tau的相對電泳遷移率加快。Mn2+和Mg2+可增加上述酶對PHFII-tau的去磷酸化作用。酶的去磷酸化作用具有濃度依賴性，隨着酶濃度的增加，去磷酸化作用增強。

因為tau蛋白異常過度磷酸化並形成PHF被認為是AD神經原纖維退化的基礎，PHF可在體外被蛋白磷酸酯酶去磷酸化的結果提示，AD腦損傷可能是可逆的。

阿爾茨海默(AD)腦中有三種tau蛋白：(1)易溶型非異常磷酸化的tau(C-tau)；(2)易溶型異常磷酸化的tau(ADp-tau)；(3)以雙螺旋絲聚集的tau(PHF-tau)。根據PHF-tau在2%十二烷基硫酸鈉(SDS)中的溶解性，又可將其分為PHFI-tau和PHFII-tau[1]。與ADp-tau和PHFI-tau不同，PHFII-tau還被部分泛素化修飾[2]。

根據Cohen[3]的分類法，大量存在於人腦中的磷酸絲氨酰和磷酸蘇氨酰蛋白磷酸酯酶主要包括四種類型:PP-1，PP-2A，PP-2B和PP-2C。從過去的研究中發現，PP-2C不使所研究的ADp-tau任何位點發生去磷酸化作用，而PP-1僅對少數位點起反應[4]。推測PP-2A和PP-2B可能在AD腦中tau異常磷酸化過程中起關鍵作用，所以二者均被選用於本研究。

一、組織和抗體來源

該研究中的AD及年齡、性別匹配對照者的腦組織來源於死後6小時內的屍體解剖(各取6例混合後製備勻漿)，AD確診基於屍檢組織切片的病理學檢查，人腦組織均貯於-75℃直至使用。牛腦PP-2A和PP-2B的分離純化分別參照Cohen等[5]和Sharma等[6]的方法。多克隆抗體92e和102C由Iqbal小組製備。單克隆抗體tau-1和PHF-1分別由Binder和Greenberg提供。單克隆抗體SMI-31，SMI-33和SMI-34從Sternberg單克隆公司購買。鹼性磷酸酶標記的抗鼠和抗兔IgG從Sigma公司購買。

二、tau蛋白樣品的製備

PHFII-tau蛋白製備參照Iqbal等[7]的長程序從AD患者腦中製備。其簡要步驟如下:將AD大腦皮質去腦膜及白質後製備勻漿，再用不同孔徑尼龍膜進行篩分，在2%SDS溶液中加熱和超聲破碎，不連續蔗糖密度梯度離心和玻璃珠層析。ADP-tau的製備參閲Kopke等[1]法。

三、去磷酸化反應

除特別標明外，去磷酸化反應均在37℃進行45分鐘。反應混合液中含50mmol/LTris-HCl(pH7.0)，20mmol/Lβ-巰基乙醇，0.1g/L牛血清白蛋白，1.0mmol/LMnCl2;各0.01g/L抑肽酶(aprotinin)，Leupeptin和胃酶抑素(pepstatin)，0.07g/LPHF-Ⅱ-tau，2U/mlPP-2A或5U/mlPP-2B(1單位PP-2A或PP-2B分別指在30℃，每分鐘催化磷酸化酶a或磷酸化酶激酶釋放1.0nmol磷酸的酶量)。在用PP-2B進行的去磷酸化反應液中，還含有1mmol/LCaCl2和1μmol/L鈣調素。ADP-tau的去磷酸化反應條件除用較低的磷酸酶濃度外[8，9]，其餘同PHFII-tau的去磷酸化條件。去磷酸化位點的檢測用免疫印跡法。

四、免疫印跡法

經去磷酸化處理的樣品先用4倍體積預冷丙酮進行沉澱，再溶於SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)樣品緩衝液，煮沸5分鐘後進行5%～15%SDS-PAGE。所用一級抗體的稀釋倍數及特性見附表。印跡樣品用鹼性磷酸酶標記的抗鼠或抗兔IgG作為第二抗體，以5-溴-4-氯-3吲哚磷酸-對氨基甲苯鹽(BCIP)和對硝基藍四唑氯(NBT)作為底物進行顯色分析。

一、PP-2A和PP-2B可在多部位使PHFII-tau去磷酸化

PP-2A(2U/ml)和PP-2B(5U/ml)可使PHFII-tau的tau-1表位顯色，PP-2A和PP-2B還分別使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化。兩種酶均使