卵黃

卵生魚卵黃的體積和密度（未必是卵的大小）嚴重影響個體發育。例如，由於卵黃外周空間不同，相同直徑的卵可能有不同量的卵黃，這可導致卵黃體積也有所不同。在大尺寸的卵中，普遍發現低密度的極小卵黃，而許多較小的卵則含有相對大的高密度卵黃。此外，不同的卵或個別雌性的卵黃數量也存在很大差別。 ^[2] 

魚卵營養組成具有種特異性，且其質量取決於母體年齡、母體重量和餌料。 有研究認為，卵黃大小和營養濃度及細胞質體積，可能對研究繁殖更有意義。然而，也有研究證明孵化時可利用的卵黃量與原始卵大小相關。大虹鱒初孵仔稚魚中，幹卵黃重量儲備的絕對量和相對量比小虹鱒孵化的仔稚魚高；來自小卵的初孵仔稚魚的卵黃為8.2mg（或72%的初孵仔稚魚重量），而那些來自大卵的卵黃有16.1mg。 ^[2] 

基於金頭鯛中的結果，魚卵黃儲備物包括蛋白質（含有豐富的基本氨基酸，如賴氨酸和精氨酸、胱氨酸和半胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）、脂質、糖元或糖脂。同時，卵黃由溶酶體酶和其他與蛋白質、碳水化合物、脂質動員相關的酶“裝配”。然而，不同的魚，卵和卵黃營養組成都是定性且定量的。 ^[2] 

卵中的蛋白質表示為幹物質的百分比，其範圍為紅擬石首魚（美國紅魚）的28.1到比目魚的79.3。脂質最小值是鯉魚的5.4，最大值為條紋鱸的52.0，碳水化合物在紅擬石首魚和美洲擬鰈中分別為04和5.3。與深海魚卵的85%-92%相比，硬骨魚卵通常含水量較低（60%-79%）。 ^[2] 

早期發育所需的營養先以YGs或血小板及油球的形式積累。在硬骨魚類卵母細胞後期發育中，卵黃由圓形或橢圓形卵黃小板組成，這些卵黃小板的大小隨卵的不同而不同，在較大的卵中，卵黃小板也較大；同一個卵中，卵黃小板也會有所不同，位於中心位置附近的卵黃小板相對更大，也比表面的卵黃小板同質性更高。卵黃小板包含兩個區域：包圍卵黃小板的膜和一箇中央核。外部的鞘由黏多糖和異源三聚體G蛋白組成。內部區域包含卵黃脂磷蛋白（Lx）和Pv，或類似的脂蛋白和磷蛋白。卵黃可能被隔絕在卵中心一個膜裏面，如青鱂、爪哇青鱅；或可能與卵質一起混入，如斑馬魚。卵黃囊通常是魚卵卵黃的主要成分。儘管動物世界的卵黃小板大小各有不同，從線蟲類秀麗隱杆線蟲YGs的1μm寬到雞蛋卵黃的140μm，卵黃囊似乎是與進化相應的細胞器。與其他大部分淡水魚相反，河鱸卵黃似乎完全同種，沒有囊泡形成也沒有卵黃小板。 ^[2] 

不同魚的油球大小、外觀和數目均不同。在居於水底或胎生魚卵卵黃囊中，存在大量直徑為1μm的小油球（金頭鯛；梭子魚）；河鱸、青鰳及其他多種魚類，散佈在卵母細胞內部的許多小油球在受精之後與一個靠近卵上部的大油球融合。石首魚在受精之後，存在大量油球，它們在孵化之前常結合成一個，其他海魚則有很多油球。與此相對照的是，也有不含油球的深海魚卵（例如鱈形、鰈形目、美洲擬鱖、大西洋庸鰈）。 ^[2] 

硬骨魚的不完全卵裂形成胚外卵黃囊。卵黃囊最主要的功能是為發育的胚胎和仔稚魚提供營養，另外還有氣體交換與排泄作用。卵黃囊最典型的特徵是卵黃多核層（ysl）。 ^[2] 

Ysl來自於卵裂早期收縮的邊緣分裂球，並在卵黃細胞和內部細胞團塊（ICM）之間形成多核體，後者是胚胎前體。研究指出，硬骨魚類早期生活史中的ys也被視為胚盤外包的主要動力。 廣泛認為，表胚層”中線粒體的高頻出現，是它作為外包驅動力的證明。早期胚胎髮育中，前神經組織的誘導和體軸腹外側中胚層的形成，以及腹外側邊緣分裂球的節-相關非基因的誘導，都歸功於ysl表達基因的控制。Ysl的功能與組織上皮的形態發生、心臟組織形態發生以及肝臟芽的形成有關。 ^[2] 

在硬骨魚胚胎中，ysl連同中胚層及外胚層圍繞整個卵黃塊分佈。與非硬骨魚類半斑目、弓鰭目、鱘目和其他一些較低級的脊椎動物相反，在胚胎和早期仔稚魚“卵黃囊幼魚”發育時期，硬骨魚內胚層和卵黃儲備之間並沒有關係。卵黃流通有專門的靜脈血管，在卵黃囊的壁中發育。通常，在肝臟入口系統形成卵黃，腸道前體血管和血管網狀組織作為肝靜脈的一部分。在硬骨魚胚胎和仔稚魚中，所有從機體發出的較大血管為卵黃囊提供血液。然而，許多物種，如金頭鯛、黑鱸、梭鱸（白梭吻鱸）或大比目魚（大菱鮃），在早期發育階段並不具有卵黃囊循環。最近有關狼鱸（條紋鱸）仔稚魚的研究結果，與在海鯛、黑鱸、梭鱸和大比目魚中報道的結果一致。在孵化後1天、3天，狼鱸仔稚魚卵黃囊中未發現血管。 總結認為，大比目魚卵黃囊中缺少血液循環系統，但並不妨礙從卵黃細胞到胚胎髮育，或仔稚魚的營養吸收和轉移。 ^[2] 

卵黃囊儲備的大部分營養需通過ys/yt到達胚胎及仔稚魚組織，在此過程中，apoE基因的表達必不可少。已有科研人員研究了內源營養的細胞學基礎，尤其是硬骨魚胚胎及仔稚魚/初孵魚苗中卵黃儲備物的利用。迄今為止，大多數研究已經確定了卵黃利用在硬骨魚發育中的作用。 ^[2] 

棕鱒（亞東鮭魚）的ysl結構在孵化之後很快在細胞質區域（ycz）組成。Ysl細胞質區域的細胞器與鮭魚初孵魚苗、大西洋庸鰈及梭鱸仔稚魚以及狼鱸類似。Ycz是一個相當複雜的結構，涉及卵黃水解、脂蛋白微粒合成及將它們運送至卵黃的循環。Ycz包含平面和粗麪內質網、大量線粒體及高爾基體複合物。所有這些部分延伸穿過Ycz的細胞器，能形成分層結構。然而，一些魚類儘管存在細胞器，但似乎並不含分層的“表胚層”，如大西洋鱈魚、大西洋庸鰈、海鯛、海鱸、碧古魚及白鱸。 ^[2] 

ysl/ytl在蛋白質從卵黃細胞運輸至胚胎和仔稚魚的過程中扮演着重要角色。蛋白質水解發生在卵黃合胞層（ysl）的卵黃血小板。由於卵黃囊自身含有水解酶，因此，在ysl發生卵黃血小板的蛋白質水解。虹鱒胚胎中有兩種酶含量不同的卵黃血小板。一種是有酶的能在ysl形成之前使營養得以釋放。第二種或是常見的缺乏這種酶的卵黃血小板類型，並被ysl結構酶消化。有人推斷，有光面內質網和大量線粒體的ysl區域及豐富的糖原顆粒會負責碳水化合物和脂質的代謝。第二個區域的特點是具有粗麪內質網和高爾基體複合物，它與蛋白質合成和運輸有關。卵黃磷蛋白脱去磷酸，通過鈣依賴性活性磷酸酯酶變成可溶。合胞體的高爾基體複合物可能為卵黃血小板的降解提供酸水解酶。 ^[2] 

在特定胚胎髮育階段，YGs才分解自身，儘管它們已經形成了好幾個星期。這與溶酶體能快速把幾乎任何蛋白質分解成遊離氨基酸、糖及其他小分子化合物相反。卵黃血小板最初是在河鱸桑葚胚階段的ysl中被發現。pH及酶對YG激活和卵黃利用調控起重要作用。YGs能調節它們的pH；初始pH是中性或微酸性，隨胚胎髮育逐漸酸化，並引起卵黃降解。 ^[2] 

卵黃蛋白質來自VtgA，完全分裂產生氨基酸。這種模式是通過分析斑馬魚胚胎和成魚組織及鱭魚胚胎中ctlsa、 ctlsb及ctlsc基因表達得以識別。在鱗魚中，組織蛋白酶原L（Ctsl）異構體最可能涉及卵黃蛋白質水解。天冬氨酸蛋白酶組織蛋白酶D（Csd）的活動似乎通常涉及脊椎動物卵黃蛋白質的降解，尤其是在斑馬魚胚胎和仔稚魚中。位於ysl的酶原Ctsl被轉移到卵黃球，從中心卵黃塊分離，它被卵黃球中的Ctsd激活成組織蛋白酶L，後者水解卵黃蛋白質。卵黃基質中的幾種酶是弱陽性的，其中包括鹼性和酸性磷酸酶、ATP酶、葡萄糖6磷酸及胰蛋白酶。 ^[2] 

儘管新受精的卵中遊離氨基酸組成相似，但對許多深海魚卵來説，並無卵黃中必需氨基酸或非必需氨基酸合成蛋白質的速率的相關規律。如條斑星鰈和大西洋庸鱖對EAA和NEAA的利用不同，而比目魚對EAA及NEAA並不存在選擇性利用。遊離氨基酸的動員，主要發生在大菱鮃孵化之前及孵化之後的短時間內，還有檬鰈胚胎及早期卵黃囊仔稚魚之中，或是大西洋庸鰈等的卵黃囊仔稚魚中。對黑鱸來説，孵化之前（18℃）就耗掉了大約60%遊離氨基酸，而來自油球的中性脂質似乎成為孵化後的主要能源基質。狹鱈的遊離氨基酸直至孵化才被利用，大概是在受精後17天；而來自VtgB磷脂和三酰基甘油的Lv的高度利用，發生在仔稚魚期間，即5℃下受精後的18-28天條斑星鰈胚胎（受精後0~10天，8℃）及卵黃囊仔稚魚（11-21日齡）對卵黃營養的利用，存在一個三相序列。它具有一個明顯模式：0-4天不利用遊離氨基酸，遊離氨基酸的損耗主要發生在4天以後，13天時僅剩13%初始遊離氨基酸。 ^[2] 

Lv和磷脂通常在受精16-21天后開始被利用。在大西洋鱈魚胚胎髮育期間，75%能量來自遊離氨基酸新陳代謝，13%來自極性脂質，9%來自三酰基甘油。孵化後，能量利用如下：遊離氨基酸2%；極性脂質20%（主要是PC）；中性脂質17%；蛋白質31%。這使得67%氨基酸和32%脂質被全利用。在大菱鮃中，深海魚卵類有一個單獨油球胚胎分解代謝和內源營養仔稚魚由氨基酸（50%，來自遊離和結合蛋白質幾乎各佔一半）和脂質（50%，主要是中性脂質）供能。同樣，遊離氨基酸（84%）是大菱鮃胚胎髮育過程中主要的新陳代謝能源。孵化之後，蠟酯（33%）和三酰基甘油（25%）是重要能源，與此同時，僅10%遊離氨基酸得以利用。對孵化後12天期間的大西洋庸鰈卵黃囊仔稚魚而言，卵黃中超過70%遊離氨基酸被利用，而卵黃蛋白質卻沒有明顯變化。這表明：當遊離氨基酸作為孵化後卵黃吸收期間的優勢能源基質時，大西洋庸蝶仔稚魚能持續利用內源儲備物。其次，其他氨基酸則來自卵黃蛋白質；孵化時，60%總氨基酸（遊離的及蛋白質氨基酸）作為魚體蛋白質合成的前體，而剩下40%則作為仔稚魚能量代謝基質。 ^[2] 

根據大量在海水魚類中的研究結果可看出，在個體發育的內源營養階段，相對於結合在卵黃蛋白質中的氨基酸而言，遊離氨基酸被較早動員（內源及新孵化的仔稚魚）。 ^[2] 

通過免疫注射產蛋雞，即可由其生產的蛋黃中提取相應的抗體，並可用於相應疾病的預防和治療，這類製劑稱為卵黃抗體。卵黃抗體在臨牀上應用較為廣泛，其優點是雞蛋比動物血清更容易獲得，且卵黃中抗體含量較高。禽類的免疫器官法氏囊主要控制機體的體液免疫，機體的免疫應答發生後，體液中成熟的骨髓依賴性淋巴細胞受相關免疫信號通路的介導，分化為漿細胞，隨即產生大量抗體釋放入血液中。血液中的大量抗體逐漸轉移入卵黃中，並適量地蓄積。收集到的卵黃抗體，即為通過同一抗原反覆刺激後產生的多克隆抗體。卵黃中主要的免疫球蛋白為IgY，其功能與作用類似於哺乳動物血清中的IgG。雞lgY的分子量約180k Da，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成，分子量分別為60~70k Da和22~30k Da，等電點約為5.2。IgY具有較強的耐熱、耐酸、抗離子強度和一定的抗酶解能力。 ^[3] 

卵黃中的主要成分是蛋白質和脂肪，其比例為1:2。大部分蛋白質都是脂蛋白，存在於卵黃顆粒中，不溶於水，只有卵黃球蛋白（α、β、γ）是水溶性的，而IgY是γ卵黃球蛋白。因此lgY的分離純化首先需要有效地去除卵黃中的脂類，從水溶性蛋白中分離IgY。目前已建立了諸如PEG、硫酸葡聚糖、天然膠，如海藻酸鈉、角叉聚糖或乙醇沉澱等方法初步純化蛋白質。 ^[3] 

1.健康產蛋雞（最好是SPF雞）、免疫抗原（如雞新城疫滅活疫苗）、弗氏佐劑。 ^[3] 

2.滅菌生理鹽水或0.01mol/L pH7.2 PBS、海藻酸鈉、飽和硫酸銨等。 ^[3] 

3.毛細滴管、注射器、碘酊棉、酒精棉、燒杯、玻璃棒、離心管、pH試紙等。 ^[3] 

4.微量振盪器、離心機、分光光度計等。 ^[3] 

1.實驗動物的選擇：選擇健康、產蛋率高的蛋雞，購進後飼養1周左右，觀察其健康情況。 ^[3] 

2.抗原的準備：免疫抗原有多種選擇，一般採用滅活的病原體，也可以選擇激素類、蛋白類物質，使用前可以選用弗氏完全佐劑乳化抗原。 ^[3] 

3.動物免疫：免疫方式主要有口鼻接種、皮內接種、皮下接種、肌肉注射、腹腔注射以及靜脈注射。禽類的免疫方式多用肌肉注射，接種中採用胸肌多點注射。使用弗氏完全佐劑充分乳化抗原。以商用雞新城疫滅活苗免疫為例，首次免疫的劑量可以控制在1~2 mL，抗原含量為0.3-0.5 mg/kg（30日齡的蛋雞免疫劑量為0.4 mg/次）2周後進行2次免疫，4周後第3次免疫之後每隔1個月可加強免疫1次。 ^[3] 

4.免疫雞血清抗體效價檢測：一般使用瓊脂免疫擴散實驗檢測免疫雞血清中的抗體效價。將免疫蛋雞所用的抗原滴加於抗原孔，免疫雞血清滴加於抗體孔。抗原孔與抗體孔之間出現沉澱線者，為陽性。最高稀釋倍數血清孔出現沉澱線，即為該血清的抗體效價。一般效價達到1:64以上時，可開始收集免疫蛋雞所產雞蛋。 ^[3] 

5.收集卵黃抗體：先用清潔水洗去蛋殼表面的糞污，再使用碘酊和酒精消毒。無菌條件下打開胚殼，傾出蛋黃至滅菌大燒杯中，以1:9的比例加入滅菌生理鹽水或0.01 mol/L pH7.2 PBS稀釋並充分混勻，調節pH至5.2，勻漿後的卵黃抗體可以進一步提純，也可加入0.01%硫柳汞或每毫升卵黃液加入青黴素、鏈黴素各1000單位進行防腐抑菌，搖勻後分裝於消毒好的瓶中，冷凍乾燥保存或製成乾粉利用。 ^[3] 

6.IgY的純化：卵黃混合液反覆凍融3次，6000 r/min離心30 min，分離出卵黃蛋白，加入終濃度0.07%的海藻酸鈉和0.02%的NaCl，振盪，使海藻酸鈉充分溶解，靜置30 min，6000 r/min離心30 min，上清液調節pH到7.2，再依次用50%、33%、3%的飽和硫酸銨（pH 7.2）提取IgY，用 SephadexG-25脱鹽。 ^[3] 

對獲得的卵黃抗體進行的效價及活性測定，可採用免疫電泳實驗、瓊脂免疫擴散實驗、血凝抑制實驗、酶聯免疫吸附實驗等多種抗體檢測方法。 ^[3]