酶的包埋法固定化技術

包埋法制備的固定化酶可防止酶滲出，底物需要滲入凝膠孔隙或半透膜內與酶接觸。此法較為簡便，固定化時一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基起結合反應，酶分子本身不參加水不溶性凝膠或半透膜的形成，僅僅是被包圍起來，因而從原理上而言，由於酶分子本身不發生物理化學變化，酶的高級結構改變較少，酶的回收率較高，適用於固定各種類型的酶。但由於只有小分子的底物和產物可以通過高聚物擴散，故包埋法適於小分子底物和產物的酶，對那些底物和產物是大分子的酶則不適合。而且高聚物網格或半透膜對小分子物質擴散的阻力有可能會導致固定化酶的動力學行為改變和活力的降低。

凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠，卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯樹脂等合成凝膠或樹脂。

天然凝膠採用溶膠狀天然高分子物質在酶存在下凝膠化的方法，包埋時條件温和、操作簡便，對酶括性的影響甚少，但強度較差。合成的高分子則採用合成高分子的單體或預聚物在酶存在下聚合的方法。合成載體的強度較高，但需在一定的條件下進行聚合反應才能把酶包埋起來，聚合反應的條件往往會引起部分酶的變性失活，所以包埋條件的控制非常重要。如聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法，製備時在酶溶液中加丙烯酰胺單體和交聯劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺，在氮氣的保護下，加聚合反應催化劑四甲基乙二胺和引發劑過硫酸鉀等使其在酶分子周圍進行聚合.形成交聯的高聚物網絡，酶分子便被包埋在剛聚合的凝膠內。

微膠囊型包埋即將酶包埋在各種高聚物製成的半透膜微膠囊內的方法。常用於製造微膠囊的材料有聚胺、火棉膠、醋酸纖維素等。

用微膠囊型包埋法制得的微囊型固定化酶的直徑通常為幾微米到數百微米，膠囊孔徑為幾埃至數百埃，適合於小分子底物和產物的酶的固定化，如脲酶、天冬醯胺酶、尿酸酶、過氧化氫酶等。此法需要一定的反應條件和製備技術，被包埋的酶不易流失。其製造方法有界面聚合法、界面沉澱法、二級乳化法、液膜（脂質體）法等。

（1）界面聚合法。此法是將含有酶的親水性單體和化分散在與水不相溶的有機溶劑中，再加入溶於有機溶劑的疏水性單體。親水性單體和疏水性單體在油水兩相界面上發生反應，形成高分子聚合物半透膜，使酶被包埋於半透膜內。常用的親水單體有乙二醇、丙三醇等；疏水單體有聚異氰酸酯、多元酰氯等。在包埋過程中由於發生化學反應，可能會引起某些酶失活。此法曾用聚脲製備天冬醯胺酶、脲酶等的微囊；

（2）界面沉澱法。這是一種簡單的微囊化法，此法是利用某些高聚物在水相和有機相面上溶解度較低而形成皮膜將酶包埋。一般是先將含高濃度血紅蛋白的酶溶液在與水不互溶的有機相中乳化，在油溶性的表面活性劑 存在下形成油包水的微滴，再將溶於有機溶劑的高聚物加入乳化液中，然後加入一種不溶解高聚物的有機溶劑，使高聚物在油水上沉澱析出形成膜，將酶包埋，最後在乳化劑的幫助下由有機相轉入水相。此法條件温和酶不易失活，但要完全除去膜上殘留的有機溶劑很困難。作為膜材料的高聚物有堆硝酸纖維素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。此法曾用於固定化天冬醯胺酶、脲酶等。

（3）二級乳化法。 該法是將酶溶液首先在高聚物有機相中分散成極細液滴，形成第一個“油包水”型乳化液，此乳化液再在水相中分散形成第二個乳化液，在不斷攪拌下，低温真空蒸出有機溶劑，使有機高聚物溶液固化便得到包含多滴酶液的固體球為囊。常用的高聚物有乙基纖維素、聚苯乙烯、氯化橡膠等，常用的有機溶劑為苯、環己烷和氯仿。此法制備比較容易，酶幾乎不失活，但殘留的有機溶劑難以完全去除，而且膜也比較厚，會影響底物擴散。此法曾用乙基纖維素和聚苯乙烯製備成過氧化氫酶、脂肪酶等微囊；。

（4) 液膜法（脂質體法）。上述微囊法是用半透膜包埋酶液，近年又研究出以脂質體為液膜代替半透膜的新微囊法。脂質體包埋法是由表面活性劑和卵磷脂等形成液膜包埋酶的方法，此法的最大特徵是底物和產物的膜透過性不依賴於膜孔徑的大小，而與底物和產物在膜組分中的溶解度有關．因此可以加快底物透過膜的速率。此法曾用於糖化酶的固定化。

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