凱氏定氮法

蛋白質是含氮的有機化合物。蛋白質與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然後鹼化蒸餾使氨遊離，用硼酸吸收後再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算係數，並換算成蛋白質含量。含氮量*6.25=蛋白含量

1.有機物中的氨在強熱和CuSO₄，濃H₂SO₄ 作用下，硝化生成(NH₄)₂SO_{4反應式為：}

2.在凱氏定氮器中與鹼作用，通過蒸餾釋放出NH₃ ，收集於H₃BO₃ 溶液中

反應式為:

3. 用已知濃度的H₂SO₄（或HCI）標準溶液滴定，根據HCI消耗的量計算出氮的含量，然後乘以相應的換算因子，即得蛋白質的含量

反應式為：

或

所有試劑均用不含氨的蒸餾水配製。

2.1 硫酸銅。

2.2 硫酸鉀。

2.3 硫酸。

2.4 2%硼酸溶液。

2.5 混合指示液：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶液與1份0.1%次甲基藍乙醇溶液臨用時混合。

2.6 30%氫氧化鈉溶液。

2.7 0.025mol/L硫酸標準溶液或0.05mol/L鹽酸標準溶液。

如圖1所示。

1.安全管

2.導管

3.汽水分離管

4.樣品入口

5.塞子

6.直形冷凝管

7.吸收瓶

8.隔熱液套

9.反應管

10.蒸汽發生瓶

1、樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當氮30-40mg），移入乾燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20毫升硫酸，稍搖勻後於瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支於有小孔的石棉網上，小火加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止後，加強火力，並保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明後，再繼續加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷後，移入100ml容量瓶中，並用少量水洗定氮瓶，洗液併入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸同一方法做試劑空白試驗。但是此法比較危險，不易在實驗室演示，大多數實驗室有消煮儀一次可以進行多個（一次可以消煮16個樣品）樣品處理，並有通風櫥進行通風，温度可以自己設定，更加安全和可操作性，因此逐步成為主要的凱氏定氮法的首選處理方法。

一般消解温度都設在240度及240度以上，如果想快速消解可以適當提高温度甚至可以用最大温度進行消解。

2、按圖1裝好定氮裝置，於水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠以防暴沸，用調壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。

3、向接收瓶內加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，並使冷凝管的下端插入液麪下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室，並以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應室，不能立即將玻璃蓋塞緊，這樣易使玻璃塞粘在進樣口，應先用蒸餾水沖洗然後再蓋，並加水於小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然後用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N鹽酸標準溶液定至灰色或藍紫色為終點。

同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

X：樣品中蛋白質的百分含量，g；

V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積，ml；

V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積，ml；

N：硫酸或鹽酸標準溶液的當量濃度；

0.014：1N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當於氮克數；

m：樣品的質量（體積），g（ml）；

F：氮換算為蛋白質的係數。

（1） 樣品應是均勻的。固體樣品應預先研細混勻，液體樣品應振搖或攪拌均勻。

（2） 樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上。萬一沾附可用少量水衝下，以免被檢樣消化不完全，結果偏低。

（3） 消化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷後，慢慢加入30%過氧化氫（H₂O₂）2-3ml，促使氧化。

（4） 在整個消化過程中，不要用強火。保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

（5） 如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。

（6） 加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作鹼性反應的指示劑。

（7） 混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

（8） 氨是否完全蒸餾出來，可用pH試紙試餾出液是否為鹼性。

（9） 吸收液也可以用0.01當量的酸代表硼酸，過剩的酸液用0.01N鹼液滴定，計算時，A為試劑空白消耗鹼液數，B為樣品消耗鹼液數，N為鹼液濃度，其餘均相同。

（10） 以硼酸為氨的吸收液，可省去標定鹼液的操作，且硼酸的體積要求並不嚴格，亦可免去用移液管，操作比較簡便。

（11） 向蒸餾瓶中加入濃鹼時，往往出現褐色沉澱物，這是由於分解促進鹼與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱後又分解生成氧化銅的沉澱。有時銅離子與氨作用，生成深藍色的結合物[Cu(NH₃)₄]²⁺

（12） 這種測算方法本質是測出氮的含量，再作蛋白質含量的估算。只有在被測物的組成是蛋白質時才能用此方法來估算蛋白質含量。

蛋白質中的氮含量一般為15～17.6%，按16%計算乘以6.25即為蛋白質。