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凱氏定氮法

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凱氏定氮法是由丹麥化學家凱道爾於1883年建立的,現已發展為常量、微量、平微量凱氏定氮法以及自動定氮儀法等,是分析有機化合物含氮量的常用方法。 凱氏定氮法的理論基礎是蛋白質中的含氮量通常佔其總質量的16%左右(12%~一19%),因此,通過測定物質中的含氮量便可估算出物質中的總蛋白質含量(假設測定物質中的氮全來自蛋白質),即: 蛋白質含量=含氮量/16%。 [1] 
凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下,用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽,然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨,隨水蒸氣蒸餾出來併為過量的硼酸液吸收,再以標準鹽酸滴定,就可計算出樣品中的氮量。由於蛋白質含氮量比較恆定,可由其氮量計算蛋白質含量,故此法是經典的蛋白質定量方法。
中文名
凱氏定氮法
外文名
Kjeldahl method
分    類
蛋白質
類    型
生物化學與分子生物學

凱氏定氮法原理

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蛋白質是含氮的有機化合物。蛋白質與濃硫酸和催化劑一同加熱硝化,使蛋白質分解,分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然後鹼化蒸餾使氨遊離,用硼酸吸收後再以硫酸或鹽酸標準溶液滴定,根據酸的消耗量乘以換算係數,並換算成蛋白質含量。含氮量*6.25=蛋白含量
凱氏定氮法 凱氏定氮法
1.有機物中的氨在強熱和CuSO4,濃H2SO4 作用下,硝化生成(NH4)2SO4反應式為:
2.在凱氏定氮器中與作用,通過蒸餾釋放出NH3 ,收集於H3BO3 溶液中
反應式為:
3. 用已知濃度的H2SO4(或HCI)標準溶液滴定,根據HCI消耗的量計算出氮的含量,然後乘以相應的換算因子,即得蛋白質的含量
反應式為:

凱氏定氮法試劑

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所有試劑均用不含氨的蒸餾水配製。
2.1 硫酸銅
2.2 硫酸鉀。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液:1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶液與1份0.1%次甲基藍乙醇溶液臨用時混合。
2.6 30%氫氧化鈉溶液。
2.7 0.025mol/L硫酸標準溶液或0.05mol/L鹽酸標準溶液。

凱氏定氮法儀器

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圖1 凱氏定氮法儀器 圖1 凱氏定氮法儀器
定氮蒸餾裝置:
如圖1所示。
1.安全管
3.汽水分離管
4.樣品入口
5.塞子
6.直形冷凝管
8.隔熱液套
9.反應管
10.蒸汽發生瓶

凱氏定氮法操作

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1、樣品處理:精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品(約相當氮30-40mg),移入乾燥的100ml或500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸銅,6g硫酸鉀及20毫升硫酸,稍搖勻後於瓶口放一小漏斗,將瓶以45度角斜支於有小孔的石棉網上,小火加熱,待內容物全部炭化,泡沫完全停止後,加強火力,並保持瓶內液體微沸,至液體呈藍綠色澄清透明後,再繼續加熱0.5小時。取下放冷,小心加20ml水,放冷後,移入100ml容量瓶中,並用少量水洗定氮瓶,洗液併入容量瓶中,再加水至刻度,混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀濃硫酸同一方法做試劑空白試驗。但是此法比較危險,不易在實驗室演示,大多數實驗室有消煮儀一次可以進行多個(一次可以消煮16個樣品)樣品處理,並有通風櫥進行通風,温度可以自己設定,更加安全和可操作性,因此逐步成為主要的凱氏定氮法的首選處理方法。
一般消解温度都設在240度及240度以上,如果想快速消解可以適當提高温度甚至可以用最大温度進行消解。
2、按圖1裝好定氮裝置,於水蒸氣發生器內裝水約2/3處加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入數粒玻璃珠以防暴沸,用調壓器控制,加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。
3、向接收瓶內加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴,並使冷凝管的下端插入液麪下,吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應室,並以10ml水洗滌小燒杯使流入反應室內,塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯,提起玻璃塞使其緩慢流入反應室,不能立即將玻璃蓋塞緊,這樣易使玻璃塞粘在進樣口,應先用蒸餾水沖洗然後再蓋,並加水於小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾,開始蒸餾,蒸氣通入反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內,蒸餾5min。移動接收瓶,使冷凝管下端離開液皿,再蒸餾1min,然後用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶,以0.05N硫酸或0.05N鹽酸標準溶液定至灰色或藍紫色為終點。
同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

凱氏定氮法計算

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X:樣品中蛋白質的百分含量,g;
V1:樣品消耗硫酸或鹽酸標準液的體積,ml;
V2:試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準溶液的體積,ml;
N:硫酸或鹽酸標準溶液的當量濃度
0.014:1N硫酸或鹽酸標準溶液1ml相當於氮克數;
m:樣品的質量(體積),g(ml);
F:氮換算為蛋白質的係數

凱氏定氮法注意

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(1) 樣品應是均勻的。固體樣品應預先研細混勻,液體樣品應振搖或攪拌均勻。
(2) 樣品放入定氮瓶內時,不要沾附頸上。萬一沾附可用少量水衝下,以免被檢樣消化不完全,結果偏低。
(3) 消化時如不容易呈透明溶液,可將定氮瓶放冷後,慢慢加入30%過氧化氫(H2O2)2-3ml,促使氧化。
(4) 在整個消化過程中,不要用強火。保持和緩的沸騰,使火力集中在凱氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下,使氮有損失。
(5) 如硫酸缺少,過多的硫酸鉀會引起氨的損失,這樣會形成硫酸氫鉀,而不與氨作用。因此,當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時,要增加硫酸的量。
(6) 加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點,硫酸銅為催化劑,硫酸銅在蒸餾時作鹼性反應的指示劑。
(7) 混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠,可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。
(8) 氨是否完全蒸餾出來,可用pH試紙試餾出液是否為鹼性。
(9) 吸收液也可以用0.01當量的酸代表硼酸,過剩的酸液用0.01N鹼液滴定,計算時,A為試劑空白消耗鹼液數,B為樣品消耗鹼液數,N為鹼液濃度,其餘均相同。
(10) 以硼酸為氨的吸收液,可省去標定鹼液的操作,且硼酸的體積要求並不嚴格,亦可免去用移液管,操作比較簡便。
(11) 向蒸餾瓶中加入濃鹼時,往往出現褐色沉澱物,這是由於分解促進鹼與加入的硫酸銅反應,生成氫氧化銅,經加熱後又分解生成氧化銅的沉澱。有時銅離子與氨作用,生成深藍色的結合物[Cu(NH3)4]2+
(12) 這種測算方法本質是測出氮的含量,再作蛋白質含量的估算。只有在被測物的組成是蛋白質時才能用此方法來估算蛋白質含量。

凱氏定氮法換算係數

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蛋白質中的氮含量一般為15~17.6%,按16%計算乘以6.25即為蛋白質。
乳製品
6.38
麪粉
5.70
玉米、高粱
6.24
花生
5.46
5.95
大豆及其製品
5.71
肉與肉製品
6.25
大麥、小米、燕麥、裸麥
5.83
芝麻、向日葵
5.30
參考資料
  • 1.    李志強.生皮化學與組織學:中國輕工業出版社,2010年