凝膠電泳

當一種分子被放置在電場當中時，它們就會以一定的速度移向適當的電極，這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率。它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的淨電荷數成正比。也就是説，電場強度越大、電泳分子所攜帶的淨電荷數量越多，其遷移的速度也就越快，反之則較慢。由於在電泳中使用了一種無反應活性的穩定的支持介質，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺膠等，從而降低了對流運動，故電泳的遷移率又是同分子的摩擦係數成反比的。已知摩擦係數是分子的大小、極性及介質粘度的函數，因此根據分子大小的不同、構成或形狀的差異，以及所帶的淨電荷的多少，便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。在生理條件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團呈離子狀態，從這種意義上講，DNA和RNA多核苷酸鏈可叫做多聚陰離子。因此，當核酸分子被放置在電場中時，它們就會向正電極的方向遷移。由於糖-磷酸骨架結構上的重複性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的淨電荷，因而它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決於核酸分子本身的大小和構型，分子量較小的DNA分子比分子量較大的DNA分子遷移要快些。這就是應用凝膠電泳技術分離DNA片段的基本原理。 ^[1] 

（1）瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳

瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，是從紅色海藻產物瓊脂中提取而來的。當瓊脂糖溶液加熱到沸點後冷卻凝固便會形成良好的電泳介質，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的。經過化學修飾的低熔點(LMP)的瓊脂糖，在結構上比較脆弱，因此在較低的温度下便會熔化，可用於DNA片段的製備電泳。

聚丙烯酰胺凝膠主要有兩種方式:一是用於分離和純化雙鏈DNA片段的非變性聚丙烯酰胺凝膠。在未變凝膠中分離DNA的缺點是DNA的遷移率受鹼基組成和序列的影響。由於無法得知未知DNA的遷移是否反常，故不能用未變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳確定雙鏈DNA的大小。二是用於分離及純化單鏈DNA片段的變性聚丙烯酰胺凝膠。這類聚丙烯酰胺凝膠是在核苷酸鹼基配對抑制劑(尿素或甲酰胺)的存在下聚合而成，變性DNA的移動速度同其鹼基組成及序列幾乎完全無關，故可用於分離及純化單鏈DNA片段和DNA測序等。

（2）脈衝電場凝膠電泳

普通的凝膠電泳技術顯然是無法分離如此超大分子量的DNA分子的。1984年，D.C.Schwartz和C.R.Cantor發明的脈衝電場凝膠電泳技術，可以成功地用來分離整條染色體這樣的超大分子量的DNA分子。在常規的瓊脂糖凝膠電泳中，超過一定大小範圍的所有的雙鏈DNA分子，都是按相同的速率遷移的。這是因為它們在單向恆定電場的作用下，僅以“一端向前”的方式遊動穿過整個膠板。而在脈衝電場中，DNA分子的遷移方向是隨着所用的電場方向的週期性變化而不斷改變的。

在標準的PFGE中，頭一個脈衝的電場方向與核酸移動方向成45°夾角，而下一個脈衝的電場方向與核酸移動方向在另一側亦成45°夾角。由於加壓在瓊脂糖凝膠上的電場方向、電流大小及作用時間都在交替地變換着，這就使得DNA分子能夠隨時地調整其遊動方向，以適應凝膠孔隙的無規則變化。與分子量較小的DNA分子相比，分子量較大的DNA分子需要更多的次數來更換其構型和方位，以使其可以按新的方向遊動。因此，在瓊脂糖介質中的遷移速率也就顯得更慢一些，從而達到分離超大分子量DNA分子的目的。應用脈衝電場凝膠電泳技術，可成功地分離到分子量高達10⁷bp的DNA大分子。 ^[1] 

凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關，瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的範圍為0.2~50kb，而聚丙烯酰胺凝膠的分辨能力要高一些，能夠分辨較小分子質量的DNA片段，其分辨範圍為1~1000bp。凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越強；反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。例如，20%的聚丙烯酰胺的分辨力可達1~6bpDNA小片段，而要分離1000bp的大DNA片段，則要用3%的聚丙烯酰胺的凝膠。2%的瓊脂糖凝膠可分辨小到300bp的雙鏈DNA分子，而對於較大片段的DNA，則要用低至0.3%~1.0%的瓊脂糖凝膠。 ^[2] 

觀察凝膠中DNA的最簡便、最常用的方法就是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。溴化乙錠是一種具有扁平分子的核酸染料，在高離子強度下，大約每2.5個鹼基插入一個溴化乙錠分子。在DNA溴化乙錠複合物中，DNA吸收254nm處的紫外輻射並傳遞給染料，而結合的染料分子本身吸收302nm和399nm的光輻射，因此吸收的能量可在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射出來。因此對核酸分子染色之後，將電泳標本放置在紫外光下觀察，便可以十分敏感而方便地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地顯現出來。在適當的染色條件下，熒光的強度是同DNA片段的大小或數量成正比的。在包含有幾種DNA片段的電泳譜帶中，每一條帶的熒光強度是隨着從最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐漸降低的。

瓊脂糖主要在DNA製備電泳中作為一種固體支持基質，其密度取決於瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定：

（1）DNA的分子大小

線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難於在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。

（2）瓊脂糖濃度

一個給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關係。凝膠濃度的選擇取決於DNA分子的大小。分離小於0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%，分離大於10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA片段大小間於兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。

（3）DNA分子的構象

DNA分子處於不同構象時，它在電場中移動距離不僅和分子量有關，還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的，超螺旋DNA移動最快，而開環雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑑定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然後電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

（4）電源電壓

在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨着電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離範圍將縮小。要使大於2kb的DNA片段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。

（5）嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用於檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的鹼基對之間並拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15%。

（6）離子強度影響

電泳緩衝液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（電導率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩衝液中（如誤加10×電泳緩衝液），則電導很高並明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 ^[2] 

脈衝場凝膠電泳在生物基因分型、分子流行病學研究、細胞凋亡、追蹤傳染源、獸醫流行病診斷輔助、食品和公共健康及染色體DNA分離等研究中有廣泛應用。 ^[3] 

脈衝場凝膠電泳用於評估同一事件中不同來源菌株可能存在的關係，是溯源的有用技術之一。當疫情爆發時， 為了採取有針對性的措施，對該疫情進行合理有效地防控， 需要明確導致疾病爆發的根本原因。脈衝場凝膠電泳技術可以在看上去分散無關係的病例中尋找關鍵聯繫，追蹤傳染源，最終達到預防和控制疾病的目的。 ^[3] 

目前（2012年），脈衝場凝膠電泳是國內外在分子流行病學研究中被廣泛接受的方法之一，被認為是細菌分子生物學技術的“金標準”，與核糖體分型相比較，脈衝場凝膠電泳的分型能力更強。脈衝場凝膠電泳分型技術是現階段霍亂流行病學調查中使用最普遍的分子分型方法。 ^[3] 

脈衝場凝膠電泳技術由於比表型鑑定和Southern雜交技術在區分亞種時更具優勢， 所以已經成為分子流行病學研究中最有效的手段。研究表明， 脈衝場凝膠電泳在醫院感染爆發流行疾病的鑑定上與PCR指紋圖譜分型同樣有效，並有着自己獨特的優勢。 ^[3] 

1996年，有學者通過進行同工酶分析與脈衝場凝膠電泳開展對牛分枝桿菌和其他複雜肺結核分枝桿菌屬的基因組分析。結果表明，脈衝場凝膠電泳是一種對牛結核分枝桿菌流行病學研究具有高度鑑別力的技術，它可以在結核獨立爆發的動物中培養、分離牛結核分枝桿菌進行分型，並確定感染源，顯示一定地域中由不同菌株造成多重感染可能性的存在。 ^[3]