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內標
鎖定
- 中文名
- 內標
- 外文名
- internal standard
- 屬 性
- 標示
- 意 義
- 用於檢測
- 應 用
- PCR 色譜 PLE 等
內標意義
1．幾種傳統定量PCR方法簡介：
（1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由於內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
（2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增後用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
（3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
2．內標在傳統定量中的作用由於傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平台期後進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平台期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重複實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標後，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
內標主要影響
1．實時熒光定量PCR無需內標實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的侷限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，並記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
（1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恆定的
（2）Ct值與起始模板的線性關係由於Ct值與起始模板的對數存在線性關係，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種採用外標準曲線定量的方法。
2．內標對實時熒光定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內標法定量的方法學比較，得出的結論是：內標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方。
AppliedBiosystems公司的7700型實時熒光定量PCR儀是全球公認的熒光定量PCR的金標準，可實現多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然採用外標準曲線的方法，而不用內標進行定量。
