內投射

本研究應用熒光逆行追蹤結合離體固定腦片細胞內注射熒光染料、DAB光轉化、免疫組化、免疫熒光、共聚焦激光掃描顯微鏡、免疫電鏡等方法，研究了大鼠運動皮層第Ⅴ層內不同投射神經元的形態與超微結構特徵，以及這些神經元與皮層內中間神經元和5-HT能傳入的聯繫。主要結果如下：

1．用熒光逆行標記、細胞內染色方法研究了運動皮層Ⅴ層的皮質脊髓神經元（PTN）與皮質丘腦（CTN）和皮質紋狀（CSN）神經元的形態特徵。結果顯示：PTN起源於深Ⅴ層，胞體較大，頂樹突較粗且有分杈，樹突棘豐富。這些神經元可能屬於慢錐體束神經元類型。相反，CSN多起源於淺Ⅴ層，少量分佈於深Ⅲ層，胞體較小，頂樹突細而不分杈，樹突棘相對較少，但所有神經元均有棘。CTN與CSN類似，起源於淺Ⅴ層和Ⅵ層的中、小錐體細胞，頂樹突較細但有些有分杈，其樹突棘最少且有一半神經元無樹突棘。這些結果表明，錐體系的PTN和錐體外系的CSN和CTN除投射部位不同外，具有明顯不同的細胞起源層次、胞體大小和樹突構築，PTN與CSN之間尤其明顯，提示這些神經元在接收皮層內、外傳入聯繫方面有所區別，因而可能在運動皮層內表現出不同的放電行為和神經整合功能

2.細胞內染色的PTN和CSN的進一步電鏡突觸學研究結果顯示，兩種神經元胞體上只有F型終末形成的對稱性突觸，以中等大小終末為主；但PTN胞體上緻密小終末較CSN的多，大終末較少。兩種神經元樹突上均能觀察到對稱性與非對稱性突觸，以對稱性突觸為主（70-90%），非對稱性突觸較少（8-25%）。這些突觸主要分佈於樹突梗，少量非對稱性突觸見於樹突棘。距胞體越遠對稱性突觸越少而非對稱性突觸越多。PTN與CSN胞體與樹突上的終末覆蓋率基本一致（30%左右），但因PTN的緻密小終末多，終末數/100 μm高於CSN。在突觸空間配布方式上兩種神經元之間存在一定差異。PTN與CSN的頂、基樹突近端的非對稱性突觸都很少，但在距胞體同等距離內，CSN樹突上的非對稱性突觸比例較PTN高。以上結果表明，PTN與CSN不僅樹突構築方面有區別，而且其突觸傳入也有所不同；雖然兩種神經元胞體與樹突上突觸分佈的基本方式相似，但在其突觸前終末形態、類型及突觸空間配布上存在區別。這些形態上的差異提示兩種神經元可能接收來自不同形態及化學類型的中間神經元傳入。

3．用免疫組化方法觀察了Parvalbumin（PV）、GABA和甘氨酸(Glycine，Gly)能中間神經元的大小、形態及分佈。PVP神經元胞體只分佈於Ⅱ-Ⅵ層，而GABA-及Gly-ir神經元在Ⅰ-Ⅵ層都可見。PV-和Gly-ir神經元總數分別佔GABA-ir神經元的59.3%和21.6%。三種免疫陽性神經元根據胞體大小和形態均可分為四種類型：大、中、小及梭形細胞。其中78%PV-ir神經元為中等細胞；而GABA-及Gly-ir神經元的小細胞數明顯較PV—ir小細胞多。Ⅱ-Ⅲ層PV-ir細胞的軸突伸入Ⅰ層併發出側枝平行於皮層表面走行，主幹再返回Ⅱ-Ⅲ層，這一現象為首次報道。PV-ir終末以Ⅱ-Ⅴ層多見，在Ⅴ層錐體細胞胞體周圍形成明顯包籃現象，但在軸突起始段上未見由終末形成的串狀-cartridge現象。而且，PV-ir終末數與Ⅴ層錐體神經元胞體的大小呈明顯的正相關關係，GABA-ir終末數則不相關。電鏡觀察顯示，Gly-ir神經元胞體和樹突上均可見對稱性和非對稱性兩種突觸，胞體上以對稱性突觸為主（79.7%），非對稱性突觸較少（20.3%）。近端粗樹突與胞體相似，而遠端則以非對稱性突觸為主。表明樹突越細，非對稱性突觸越多而對稱性突觸越少。這些結果提示，皮層內中間神經元十分複雜，具有形態及化學多樣性，這些形態各異及不同化學性質的中間神經元終末在皮層內各層次以及錐體神經元各部位的分佈各異，從而可能發揮不同的作用。

4．為進一步瞭解PV-ir終末在PTN、CSN和CTN胞體、樹突與軸突上的整體分佈狀況，採用Fast Blue逆行標記、固定腦片細胞內注入Lucifer Yellow結合免疫熒光、Confocal顯微鏡觀察，研究了三種投射神經元與PV-ir終末的關係。結果表明：在三種投射神經元胞體上均有PV-ir終末包繞，形成明顯的包籃現象，但三種神經元胞體周圍的終末數未見明顯區別。陽性終末還分佈於近端樹突上，距胞體越遠其分佈越稀疏；在距胞體50μm以上的頂樹突、30μm以上的基樹突及其二、三級分枝的遠端樹突上仍有少量終末分佈。此外，三種神經元軸突起始段（AIS）上也有少量終末接觸，但未形成明顯的cartridge現象。這一結果説明，在三種錐體神經元胞體和近端樹突上主要為PV-ir的GABA能神經元終末配布，且三種神經元之間無明顯差異；而這些神經元軸突起始段及遠端樹突上的抑制性傳入終末則較少含PV。

5．為了探討運動皮層內5-HT能傳入在運動皮層的分佈及其作用方式，用免疫組化方法研究了大鼠運動皮層內5-HT能纖維與5-HTR的分佈及二者與皮層內錐體神經元和中間神經元的關係。結果顯示：5-HT-ir纖維與5-HTR均廣泛分佈於運動皮層，但二者在層次分佈及與錐體神經元的關係方面存在不匹配現象。5-HT-ir纖維與錐體神經元胞體與樹突均很少接觸，但與PV-ir中間神經元形成明顯的突觸樣接觸。相反，5-HTR則呈斑點狀大量分佈於皮層內的錐體及非錐體神經元胞體與近端樹突內。電鏡下，5-HTR-ir產物主要與胞漿內內質網膜及樹突內微管等聚集在一起，呈不均勻分佈。在毛細血管周圍也有明顯的5-HTR-ir樹突與血管內皮細胞緊密接觸，但與突觸活性區關係不明顯。結果提示皮層內主要為5-HT〓和5-HT〓受體；5-HT能纖維與5-HTR在層次分佈及與皮層內錐體神經元之間的關係方面存在不匹配現象,説明5-HT釋放後除少量通過突觸方式作用於中間神經元外，可能主要以彌散的、非突觸傳遞方式作用於皮層內錐體神經元，起到神經調質的作用。

以上結果表明，運動皮層內錐體系和錐體外系投射神經元除投射部位不同外，其細胞起源層次、形態、大小、樹突構築及突觸配布等方面均有所區別。這些形態上的差異不僅反映出兩類神經元在接收皮層內、外興奮性與抑制性傳入聯繫方面存在區別，而且提示兩類神經元對傳入信息的空間與時間整合特性也可能不同。神經元胞體與近端樹突上大量接收PV—ir的GABA能傳入而強烈抑制錐體神經元的興奮性。5-HT能傳入在皮層內可能有兩種作用方式。其一，少量以突觸傳遞方式作用於GABA能中間神經元，進而前饋抑制錐體神經元；其二，主要通過彌散的、非突觸傳遞方式調質錐體神經元的活動。本研究首次證實了運動皮層內向脊髓投射的錐體系神經元與向尾殼核和丘腦投射的錐體外系神經元具有明顯不同的樹突構築和突觸配布，以及這些神經元與皮層內中間神經元和皮層外傳入纖維的聯繫。這些結果為進一步研究運動皮層神經元間的組構，以及瞭解錐體系和錐體外系的功能和運動控制的機理提供了依據。