免疫熒光檢查

將免疫學方法（抗原抗體特異結合）與熒光標記技術結合，檢查特異蛋白抗原在組織或細胞內分佈的方法。由於熒光素所發的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位。

免疫熒光檢查可分直接法、間接法、夾心法和補體法。

1. 直接法

將標記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標本上，經一定的温度和時間的染色，用水洗去未參加反應的多餘熒光抗體，室温下乾燥後封片、鏡檢。

（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS於待檢標本片上，10分鐘後棄去，使標本保持一定濕度。

（2）滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液，使其完全覆蓋標本，置於有蓋搪瓷盒內，保温一定時間（參考：30分鐘）。

（3） 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗後，再按順序經過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3～5 分鐘，不時振盪。

（4）取出玻片，用濾紙吸去多餘水分，但不使標本乾燥，加一滴緩衝甘油，以蓋玻片覆蓋。

（5）立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度來判斷免疫複合物的多少，常用半定量法，（-）陰性，無熒光；（±）高倍鏡下似乎可見；（+）低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下明顯可見；（++）低倍鏡下明顯可見，高倍鏡下清晰可見；（+++）低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼；（++++）低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼。

2. 間接法

如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗原—抗體—抗體複合物，再用水洗去未反應的標記抗體，乾燥、封片後鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為第一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。

（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS於已知抗原標本片，10分鐘後棄去，使標本片保持一定濕度。

（2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置於有蓋搪瓷盒內，37℃保温30分鐘。

（3）取出玻片，置於玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1～2次，然後按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5分鐘，不時振盪。

（4）取出玻片，用濾紙吸去多餘水分，但不使標本乾燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。

（5）將玻片平放在有蓋搪瓷盒內，37℃保温30分鐘。

（6）重複操作步驟（3）。

（7）取出玻片，用濾紙吸去多餘水分，滴加一滴緩衝甘油，再覆以蓋玻片。

（8）熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結果判定同直接法。

1.直接法

（1）細胞間熒光提示天皰瘡。

（2）基底膜熒光帶：在系統性紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡的皮損，均可見顆粒狀的以IgG為主的帶狀分佈。在類天皰瘡為線狀的以IgG為主的帶狀分佈。

（3）在真皮內血管壁見到圈狀熒光提示血管炎。

2.間接法

抗核抗體陽性可見於以下疾病。

（1）風濕性結締組織病：紅斑狼瘡、硬皮病、乾燥綜合徵、類風濕性關節炎等。

（2）增生性疾病：高球蛋白血癥性紫癜、巨球蛋白血癥、淋巴瘤、慢性白血病、癌腫等。

（3）感染性疾病：結核病、瘤型麻風、組織胞漿菌病。

抗核抗體本身並非特異，滴度和核型對診斷也有重要參考價值。因此除定性外，還應結合滴度、核型及臨牀體徵才具有較大價值。

3.補體結合法

常用來檢測患者的自身抗體，如妊娠皰疹患者。