光纖生物傳感器

生物傳感器是將生物物質(比如酶、細胞、蛋白質、抗體、抗原、DNA等)作為識別物，把生物化學反應轉換成為能夠定量的物理或化學信號，從而實現對生命、化學物質檢測及其監控的裝置。生物傳感器不僅涉及到了現代生物技術、微電子學，還涉及到了光學、化學等多個研究領域，並且在醫學和食品檢驗等多個領域中都有極為廣泛的應用，尤其是在醫學研究及臨牀診斷中具有極大的優勢，因此近年來成為了科學家們研究的熱點 ^[1]  。

光纖生物傳感器結構主要有光源、光纖、生物敏感元件及信號檢測系統等,其中的生物敏感元件是傳感器的關鍵部件,常用的生物敏感元件主要有抗原抗體、酶及核酸等。被測物與特定的生物敏感元件選擇性相作用(即抗原抗體或受體配體特異性結合;核酸分子鹼基互補配對;酶對底物作用專一性等),產生的生物化學信息調製光纖中傳輸光的物理特性如光強、光振幅、相位等。因此這種傳感器有較強的選擇性和很高的靈敏度,而且在分析過程中可省去對測試物分離提純等繁瑣工作,但上述形成的複合物或產生物產生的光譜行為相似,單靠光纖本身無法區分,常需使用指示劑或標記物,如:酶、熒光物質、酸鹼指示劑和斕系鰲合物等:同其它生物傳感器相比,光纖生物傳感器結合了光纖傳感的特點,具體體現在:(l)由於光纖本身良好的絕緣屏蔽作用,其抗干擾能力強,不受周圍電磁場的擾動。(2)不需要參考電極,探頭可小型化,操作方便。(3)可實現遙測,並能進行實時、在線和動態檢測。(4)響應速度快,靈敏度高 ^[2]  。

生物傳感器按是否使用標記物分為兩類：一類是標記型生物傳感器，檢測時先用熒光素、放射性同位素或酶等標記物對被測生物進行標記，然後通過檢測標記物的信號來獲取被探測物的信息。目前使用的免疫傳感器大多數屬於這一類，然而利用放射性標記物檢測，對於工作人員具有一定的危害，用熒光檢測時非特異性熒光也會影響測量結果。標記型生物傳感器所用的測試儀器體積大、價格昂貴、耗時，需要專業人員完成，並且指示劑價格昂貴，要集合幾十個樣本同時測量，讓患者在等待中承受巨大的痛苦。另一類是免標記型生物傳感器，不需要對探測物進行標記，而是直接通過生物複合物形成時的物理、化學變化對生物對象進行檢測，極大地簡化了操作過程，因此免標記生物傳感器成為了生物傳感器的一個重要研究方向 ^[1]  。

免標記生物傳感器按照工作原理不同分為：表面等離子體諧振腔生物傳感器、光學諧振腔生物傳感器、光子晶體生物傳感器和光纖生物傳感器等。免標記光纖生物傳感器是免標記生物傳感器家族中的重要一員，是光纖技術與生物技術結合的產物。由於光纖傳感器具有靈敏度高、結構簡單、不易受電磁干擾等其它器件所不具備的優點，而免標記的生物檢測方法又可以將生物化學反應直接轉變為可測信號，不需要加入標記物，測試過程簡單直接，因此免標記光纖傳感器已經成為生物傳感器研究的重要方向 ^[1]  。

免標記光纖生物傳感器的功能是將光纖上的生物敏感膜和被測物質直接接觸時發生的特異性吸附反應轉換成光信號，檢測生物分子的特性。光纖生物傳感器由兩部分構成：傳感段和傳輸段。在傳感段， 首先要對光纖傳感頭表面進行特殊化學處理，如利用偶聯法、自組裝或偶聯法結合卵白素-生物素橋連法等方式將生物靶分子固定於傳感頭表面。在發生生物化學反應時，目標分子會吸附於光纖傳感頭表面的生物膜層上， 使生物膜層厚度增加，改變傳感頭表面的等效折射率，從而影響傳輸光信號的特性，如：諧振波長、光功率等。通過檢測傳感器輸出光信號的變化就可以對被測生物分子的物理化學特性進行監測； 另一部分是傳輸段，主要負責光信號的傳輸，一般會保留該段光纖的包層 ^[1]  。

光纖生物傳感器技術發展了近 30 年的時間，在國外，已經被廣泛用於物質測定，比如除草劑、尿蛋白中的刺激性藥物、與 VIII 因子相關的抗原、人體 IgG 和 IgM、牛血蛋白—包括牛血紅蛋白和牛血清蛋白、 人體細胞中的紅細胞和 T 淋巴細胞核粒細胞、血清 HIV 特異性抗體和血管內皮生長因子等。在國內，檢測諸如葡萄球菌腸毒素、胰島素、 甲胎蛋白和日本吸血蟲抗體等物質也有采用光纖生物傳感器的方案。然而常用的光纖生物傳感器還是基於標記方法， 免標記光纖生物傳感器還處於實驗室研究階段 ^[1]  。

目前得到廣泛研究的免標記光纖生物傳感器按照工作原理不同可以分為： 光纖表面等離子體共振生物傳感器、光纖倏逝波生物傳感器和光纖光柵生物傳感器等 ^[1]  。

光纖表面等離子體共振 (Surface plasmon resonance, SPR) 生物傳感器主要是基於光纖表面等離子體共振傳感原理， 通過探測光纖表面倏逝場區內折射率的變化來分析被測生物分子的特性。當倏逝場的區域內生物分子發生識別反應時， 金屬薄膜表面的折射率會隨之變化從而改變表面波的共振角度。 共振角度變化的幅值取決於倏逝場區的平均有效折射率， 通過檢測這一變量就能夠確定分析物在該區域的結合數量。由於該傳感器具有生物樣品無需標記且可實時監測反應動態過程的特點， 特別適於生物分子的檢測以及分子之間相互作用的研究 ^[1]  。

2009 年，比利時 Jeroen Pollet 等用環氧樹脂將長為 3 cm，直徑 400 m，數值孔徑 0.39 的多模光纖粘於注射器針頭處，在光纖端部 1 cm 區域塗覆 50 nm 的金膜實現光纖表面等離子共振。光纖端面可以看作金屬反射鏡，將光波反射回光譜儀。傳感器系統由光源、光譜儀、光纖耦合器和傳感頭構成 ^[1]  。

生物傳感頭的製作方法如下： 首先利用一夜孵化的方式將單層自組裝羥基/羧基巰基混合聚乙二醇固定於金傳感頭表面，然後吸附鏈鎖狀球菌，利用 NaCl 和 NaOH 混合溶液沖洗傳感頭，將未固定的多餘鏈球菌清洗乾淨就製成了生物傳感頭。 利用這一傳感頭對生物素單層 DNA 進行了探測，觀測到了 5.0±1.0 nm 的波長漂移。研究結果表明，該傳感器能夠檢測到的 DNA溶液的濃度範圍是 0.5~5 M，對免疫球蛋白 IgE的檢測精度能達到 2 nM。同時，利用這一傳感器還可以實時監測 DNA 分子的雜交與分解運動，實驗中檢測到了 DNA 分子的分離常數為 30.9±2.9nM ^[1]  。

2011 年，該課題組又製作了順磁性材質修飾的納米光纖 SPR 生物傳感器，實現堅果過敏源的精確快速檢測。 利用順磁性材料修飾的光纖 SPR傳感器對 Ara h1 探測的靈敏度為 0.09 g/mL，比普通的光纖 SPR 傳感器的靈敏度 9 g/mL 高了兩個數量級。該傳感器能夠在 1.0~2 g/mL 的範圍內線性動態測量，並且能夠重複使用 35 次而不降低傳感靈敏度 ^[1]  。

2012 年，加納的 Akowuah E K 等理論研究了光子晶體光纖 SPR 生物傳感器，利用 HE11和HE11模對生物膜檢測。HE11和 HE11模振幅檢測靈敏度能夠達到 4×10 5 RIU 1和 8×10 5 RIU 1，而波長檢測靈敏度達到 5×10 5 RIU 1和 6×10 5 RIU 1。2013 年，重慶理工大學的劉盛平等研製了一種用於心肌肌鈣蛋白 I (cTn I) 檢測的局域 SPR光纖傳感器。 在光纖局部腐蝕掉包層後利用納米銀膜形成 SPR，用葡萄球菌 A 蛋白作為鼠抗人 cTn I的連接體，實現對 cTn I 濃度的檢測。結果表明，當 cTn I 濃度在 20~120 ng/mL 範圍內時，消光峯位移的對數與濃度呈線性關係， 線性係數為 0.9962，利用夾心法能實現 10 ng/mL 的檢測靈敏度 ^[1]  。

光纖倏逝波傳感器是基於倏逝波原理工作的，光纖中的倏逝波是光在纖芯與包層間進行全內反射式傳輸時產生的。當光以一定角度入射時，在纖芯與包層的分界面上就會產生全反射， 部分光會垂直於分界面透射至包層中， 但透射波的幅值隨着透射深度的增加而呈指數衰減， 所以只能存在一段很小的距離，一般在波長量級，這種波就稱之為倏逝波。作為生物傳感器使用時，要將傳感段的光纖包層去除，當分析物與識別分子發生生化反應時，會被吸附於纖芯表面，從而影響倏逝波的透射深度，這時傳輸光能量就會發生變化，通過檢測傳輸光的特性就能得到被測生物分子的特徵。按照光纖倏逝波生物傳感器的結構， 可以將其分為 3 種：第 1 種是直型 (是光纖纖芯直徑)，直接剝去光纖的包層，在光纖纖芯固定識別分子， 實現對被測分子的檢測。這種結構中傳輸段和傳感段之間由於結構的突然變化會出現模式的不匹配，增加傳輸損耗，從而影響到測量的靈敏度。2010 年，印度 Sai V V R 等人利用 280 nm 的紫外光 LED 作為光源對生物分子進行檢測。將 200 m 直徑的光纖 15~30 cm，中間 5 cm 利用機械方法剝去包層，再用 0.3 m 的拋光紙拋磨端面。 傳感部分表面用鉻酸溶液浸泡產生羥基組團，再用去離子水沖洗後置於 115 ℃烤箱中烘乾 2 h，浸入 1%的酒精硅烷溶液將傳感區進行硅烷化。 經過化學處理的傳感頭在 0.1 mg/mL 的人IgG 抗體溶液中孵化 16 h，再用磷酸鹽緩釋液(phosphate buffered saline, PBS) 沖洗乾淨就製成了生物傳感頭。 實驗室中利用該傳感器對 50 g/mL的羊抗人 IgG 進行探測， 吸光率能夠達到的最大值為 0.036。第 2 種是錐型， 這種結構可以避免光纖探針結構的突變，纖芯以錐形區過渡至傳輸段。這種結構增加了傳感區的面積和倏逝波的透射深度，提高了靈敏度，是目前最常用的一類倏逝波傳感器。 2010 年， 伊朗 Mohammad IsmailZibaii 等人通過將單模光纖拉錐的方法測量溶液中大腸桿菌的增長速度。 錐形光纖是用熱拉的方式實現的，光纖的錐腰直徑是 6~7 m，錐形區長度為 3 mm。在光纖的錐區通過塗覆多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine, PLL) 來吸附細菌。在適當的條件下當細菌逐漸增長時， 錐區吸附膜層的折射率也在增加，從而影響了倏逝波的穿透率，測量靈敏度達到了 60 E. coli mm 2。第 3 種是 U 型。為了進一步提高探測的靈敏度， 人們通過使傳感部分的纖芯發生彎曲的方法來提高倏逝波的透射深度。研究表明， 這種結構比起直型傳感器的靈敏度有很大的提高，且隨着彎曲半徑的減小靈敏度迅速增加。但這種結構體積比起前面幾種要大很多，而且製作相對困難，由於彎曲後內外兩面受力不均，光纖也容易折斷 ^[1]  。

根據敏感元件不同,光纖生物傳感器可大致分為免疫傳感器、酶生物傳感器和核酸傳感器等,現分別作詳細介紹 ^[2]  。

這是目前研究與應用較多的光纖生物傳感器。光纖探頭多位於軸向近端面,須去除保護層和包層,裸露纖芯,再對纖芯進行硅烷化處理,然後抗體藉助雙功能交叉聯結劑共價連接在硅烷化纖芯表面C抗體的固定方式是影響傳感器檢測靈敏度的重要因素 ^[2]  。

光纖酶生物傳感器用酶作分子識別器,與光纖結合起來,對測試物進行分析,常用的酶有氧化還原酶(如乳酸脱氫酶、葡萄糖氧化酶等)和水解酶(如鹼性磷酸酶、乙酞膽鹼酶等)。根據換能器的能量轉換方式可分為化學發光型、熒光型、生物發光型、光吸收型、指示劑型等 ^[2]  。