促前胸腺激素

PTTH有兩個特別之處，一是其功能重要，二是它的研究路徑蜿蜒曲折，有些八卦可以講講。昆蟲的一大特點是其變態發育。很多昆蟲需要經過卵-幼蟲-蛹-成蟲這幾個形態和行為都很不相同的階段。所以昆蟲在發育到需要變態的臨界點時，如從幼蟲變態成蛹，需要做兩件事情：一是表達蛹期所需的基因，抑制幼蟲期的基因，產生新的蛋白，降解不需要的蛋白；二是各個器官要能在變態的過程中步調一致。昆蟲的一種小分子激素，蜕皮激素，和這兩個過程都密切相關：它在適當的時間產生，擴散到各個組織的細胞裏，調節與變態發育相關基因的表達。絕大部分的蜕皮激素由昆蟲的前胸腺(prothoracic gland)分泌。PTTH則是從神經系統裏分泌出來的小分子蛋白，它可以刺激前胸腺分泌蜕皮激素。這樣，我們可以看到一條簡單而又很符合邏輯的路線：

內在和外源的信號—神經系統感受——調節PTTH——PTTH刺激前分泌刺激激素——蜕皮激素廣泛地調節基因——昆蟲變態發育

看起來簡單明瞭的東西，研究起來可沒那麼簡單。對PTTH的研究，最早可以追溯到上世紀在七十年代末，哈佛大學的Riddiford和Williams 用生理學方法確定了PTTH的存在：由神經元分泌的；能刺激前胸腺產生蜕皮激素。當時他們用的昆蟲模型是煙草天蛾 (Manduca)，主要原因是這種昆蟲夠大，在做生理學實驗時有較大優勢。

後來Williams 老了；Riddiford離開哈佛後，她的研究興趣集中在蜕皮激素的功能上，而沒有太關注蜕皮激素是怎樣被調節的。PTTH的工作就被北卡大學的Bollenbacher 和 Gilbert 接管。他們在整個八十年代工作主要包括兩方面：PTTH通過什麼機理調節前胸腺分泌蜕皮激素？PTTH是一個什麼樣的蛋白？第二個問題更關鍵，因為只有知道了PTTH是什麼東西以後，才能進一步深入研究其功能。在那個時候，他們用的策略很簡單：

分離煙草天蛾的腦蛋白——用生理學方法測定分離組分的活性——在進一步分離純化——測蛋白序列（抗體制備）

他們進行了將近10年的努力，還是沒有得到PTTH的部分蛋白序列，因為PTTH的含量非常低。不過他們通過提取出的含PTTH的組分製備了抗體，通過生理和生化實驗證明了該抗體可以特異地阻斷PTTH活性，同時也檢測到了表達PTTH的兩對神經元（如圖1）

在PTTH蛋白純化和序列測定方面，日本人Ishizaki 領導的課題組用家蠶為模型，取得了重大進展。他們先得到了部分蛋白序列，然後根據蛋白序列設計引物，得到了編碼PTTH的基因序列。這樣，PTTH的面紗就被揭開了：109個氨基酸組成的蛋白質，含有三對鏈內二硫鍵和一對鏈間二硫鍵；在生理狀況下，PTTH是一個二聚體。這個工作對於分子生物學來説，是小菜一碟。但在1990年，這是一流的工作。因為煙草天蛾也是研究PTTH的主要模型，Gilbert等人想通過家蠶的序列為參考，直接用PCR的方法得到煙草天蛾的序列。但這兩個物種的PTTH的DNA序列同源性卻出奇地低，直到2003年，煙草天蛾的序列才被一個日本的實驗室克隆出來。

知道了家蠶PTTH的序列後，就可以用分子生物學方法得到比較大量的純PTTH，這對研究家蠶PTTH如何調節前胸腺分泌蜕皮激素提供了很大的方便。在2003年以前，研究煙草天蛾的人就都比較鬱悶，他們還是要用大量的昆蟲的腦子來純化有活性的PTTH。在整個九十年代，除了Bollenbacher， Gilbert和Ishizaki，陸續有別的課題組加入了對PTTH和前胸腺的研究，發現PTTH能改變細胞的鈣離子和CAMP濃度，也影響了細胞內MAPK的活性。

PTTH的故事到此只講了一半，還有兩個重要的問題沒有解決：一是把PTTH基因敲除後，是否能有效抑制昆蟲發育？二是PTTH作為一種神經肽，它的受體是什麼？

對於第一個問題，在家蠶或煙草天蛾中很難回答，因為這兩種昆蟲的遺傳背景不清楚、可用的分子遺傳學操作方法也幾乎沒有。Gilbert在臨退休前終於想通了，他與明尼蘇達大學的O’connor實驗室合作，用果蠅為模型，通過遺傳學方法來研究PTTH的活體功能。當然，這個研究的前提是他們發現了在果蠅中也存在PTTH ，雖然與家蠶或煙草天蛾的同源性很低，但它們的7個形成二硫鍵的半胱氨酸是保守的。O’connor實驗室所用的敲除PTTH的方法不是傳統的基因敲除，而是“細胞敲除”。他們通過在PTTH表達的兩對細胞中特異表達凋亡基因，從而把它們除去（如圖2，圖2中A中有四個表達PTTH的細胞；圖2B中，這四個細胞死亡消失了）。

它們發現，敲除PTTH的果蠅延長在幼蟲期的生長，長成了大幼蟲；化蛹後，個體也比正常的果蠅要大 （如圖3，圖3中C, D, E分別是果蠅的幼蟲，蛹和成蟲期。在圖3的C、D、E三個小圖中，最左邊的果蠅是PTTH敲除的，中間和右邊是正常的果蠅作為對照）。

（McBrayer et al., 2007）

這説明了果蠅的PTTH在活體狀態下，確實可以影響果蠅的發育速度和最終的體積。他們用其他幾個實驗證明了PTTH的這個功能是通過調節蜕皮激素而實現的。對於詳細的內容，感興趣的博友可以看一下原文（McBrayer et al., 2007 Developmental Cell）.

O’connor他們用的這種細胞敲除的方法與傳統的基因敲除相比，有快捷、特異、容易操作的優點。但有兩個明顯的缺點：第一，他們把分泌PTTH的整個細胞都除掉了，這意味着不但PTTH被除掉了，而且這四個細胞履行的其他功能也一同被除掉。我們有理由懷疑， PTTH細胞敲除的果蠅表現出來的某些性狀可能與PTTH無關，而是因為這四個細胞被除去後造成的副作用；第二，誘導細胞凋亡是要有一個過程的，所以在PTTH細胞被完全除掉以前，它們還能分泌PTTH。雖然與正常個體相比，這個量很低，但也不能排除這些殘留的PTTH還有一定作用。

從它們的結果看來，PTTH細胞除去以後，果蠅並沒有完全失去產生蜕皮激素的能力，只是滯後了其產生的時間和降低了其濃度。有幾種可能性可以解釋這個現象：一、如上一段所説的，PTTH沒被除乾淨；二、除了PTTH，還有別的蛋白因子也能刺激前胸腺分泌蜕皮激素；三、PTTH只是促進前胸腺分泌蜕皮激素，把PTTH拿掉，前胸腺仍然能分泌蜕皮激素。依我的瞭解，第三種可能性最大，有幾個理由，在這裏就不贅述了。其中的一個理由是，在生物體內的控制調節中，很多過程不採用0和1 的方式，而是採用1-0.5-0的方式。也就是説如果正負調節都沒有，這個基因有一定的表達量（0.5的水平），受到正調節時變為高水平表達（1），受到負調節時變為很低的表達（0）。我們很容易理解1-0.5-0的控制方式比1-0要穩定很多。所以生物在進化的過程中，更喜歡前者。

關於PTTH的體內活性，就講這麼多，不再扯遠了。下面講講PTTH的受體。我在2001 年的時候，聽説日本人分離出了PTTH受體，但一直到2006年，他們的工作才發表在日本國內出版的一本雜誌上，而且論文裏沒有確定地説，這就是PTTH受體。他們克隆出來的是一個7次跨膜的G蛋白偶聯受體(GCPR)。很多小分子蛋白激素的受體都是GCPR。但也有例外，如著名的胰島素的受體就不是GCPR。

Gilbert和O’connor號稱找到了PTTH受體，發表在這個月4號的Science。他們沒有用分子生物學方法來分離受體，而是根據已知的實驗結果，猜測PTTH的受體可能是哪一類型的膜蛋白。最近幾年對前胸腺的研究結果表明，MAPK這個蛋白激酶途徑在控制分泌蜕皮激素的過程中起關鍵作用。他們就猜測PTTH的受體可能是受體酪氨酸激酶（RTK ）。果蠅裏有好幾種RTK，他們發現其中一種名為Torso的RTK在前胸腺中專一表達。而且Torso的一個已知受體Trunk與PTTH的結構有類似之處：含有7個形成二硫鍵的半胱氨酸。如果Torso真的是PTTH受體，則這個信號傳導途徑如下：

（Rewitz et al., 2009）

因為敲除PTTH會導致蜕皮激素分泌下降、幼蟲發育延長、體積變大。如果上面這個信號途徑是對的，那麼特異地在前胸腺中敲除或降低Torso，或者細胞內MAPK途徑的任何一個成員(Ras, Raf, or ERK)，都會產生和PTTH類似的表型。他們的實驗結果很好地吻合這個猜想。這樣，他們就認為Torso是PTTH的受體。當然，文章要發在Science上，光做這些還不夠，他們還做了其他一些實驗來驗證他們的模型。他們也在家蠶裏發現了Torso的同源基因，而且證明了家蠶的Torso能響應家蠶PTTH的信號。詳細的可以看看原文（Rewitz et al., 2009 Science）。

故事就講完了。PTTH的研究大概可以樹以下幾個里程碑：（1）檢測到PTTH的存在；（2）克隆PTTH基因；（3）證明PTTH在活體狀態下的功能；（4）受體的克隆。還有很多東西可以做，但主線已經基本清楚了。如無大的意外，PTTH 的故事可以被寫入昆蟲學的或內分泌學的教科書中。

小結一下：（1）PTTH的研究是很有意思的研究，但不是很重要的研究，也不是熱門的研究，是一個普通的基礎研究。它的研究結果不會直接影響到我們的生活。但對一些大的研究方向，如內分泌調節、信號轉導、生物進化，都有一些影響和啓示。（2）PTTH的研究隊伍不大，尤其在美國，主要是Gilbert在那裏為了PTTH忙碌了一輩子，也帶了幾個研究生，算是培養了幾個人才。基礎研究就是這樣，你喜歡搞，而且能説服別人給錢你去搞，就搞搞。（3）PTTH的研究不算順利，一方面受技術的限制，令一方面受生物複雜性的影響，走 了一些彎路，犯了一些錯誤。這也是很正常的。