一種有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法

骨髓和臍帶血是人的造血組織，含有豐富的各系造血幹細胞/祖細胞及大量的成熟細胞，如：紅細胞、白細胞、血小板等，各系幹細胞又因為各自表面所含有的抗原性不同，可以分為一百多種，如CD34、CD117、CD10、SCA-1、Lin-等。各系幹細胞和成熟的白細胞均為有核細胞。有核細胞中包含單核細胞，多核細胞，淋巴細胞及各系幹細胞/祖細胞，間充質細胞等。

2006年8月前，世界上從骨髓、臍帶血中分離提取幹細胞的方法很多：有按照細胞的類型分離的，如單純分離單核細胞、分離間充質幹細胞、分離淋巴細胞等，有按其細胞表面抗原不同分離某一類幹細胞的，如分離CD34、CD117、CD10等，所採用的方法有磁珠法，免疫熒光標記法，富選法，流式細胞儀法等。

這些方法所存在的共同問題是：第一不能有效保留所有類型的幹細胞，第二造價貴，第三技術條件要求較高，離工業化生產有一定的距離，在臨牀推廣應用上有一定的難度。 ^[1] 

《一種有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法》的目的就在於克服上述2006年8月前已有技術的缺陷，提供一種從人類骨髓和臍帶血中分離有核細胞的體外分離試劑盒，該技術不僅具有方法簡單，造價低廉，可以工業化生產，易於推廣的特點，最重要的可以保留骨髓和臍帶血中所有的造血幹細胞。

該發明的另一是目的提供採用上述試劑盒分離有核細胞的分離方法。 ^[1] 

一種有核細胞體外分離試劑盒，其特徵在於該試劑盒中包含有紅細胞沉澱劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400^#或HISTOPAQUE1077和細胞保養液，各試劑溶液分開保存；所述紅細胞沉澱劑是指由0.4％～1.2％的羥乙基澱粉或羧甲基澱粉或甲基纖維素與0.2％～0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，該水溶液pH為7～8：所述泛影酸鈉-聚蔗糖400^#由0.3％～1.5％泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400^#組成的水溶液，鈣水溶液pH值為7～8；所述細胞保養液為磷酸緩衝液或生理鹽水；上述有核細胞體外分離試劑盒的應用方法，其工藝過程為：首先用細胞保養液將骨髓或臍帶血稀釋，然後與紅細胞沉澱劑混勻，靜置8～20分鐘後收取上清液，離心濃縮，濃縮液再加入泛影酸鈉-聚蔗糖400^#或HISTOPAQUE1077後離心分離20～30分鐘，吸取有核細胞層，用細胞保養液清洗1～4次即可。 ^[1] 

《一種有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法》既能分離骨髓又能分離臍帶血，所分離出的有核細胞存活率≥98％，有核細胞回收率≥85％，如果能按無菌要求操作，在局部100級潔淨工作台中，分離不會因試劑而污染而且所分離出的細胞表面沒有任何標記物，不改變細胞的生物活性。

該發明的試劑盒可工業化生產，以實現了人類造血幹細胞分離、純化技術的推廣，使醫生可以象用藥一樣方便的使用細胞來治療病人。 ^[1] 

1.一種有核細胞體外分離試劑盒，其特徵在於該試劑盒中包含有紅細胞沉澱劑、泛影酸鈉-聚蔗糖400^#或HISTOPAQUE1077和細胞保養液，各試劑溶液分開保存，上述紅細胞沉澱劑是指由0.4％～1.2％的羥乙基澱粉或羧甲基澱粉或甲基纖維素與0.2％～0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，或0.4%~1.2%的羧甲基澱粉與0.2%~0.4%葡萄糖酸鈣組成的水溶液，或0.4%~1.2%的甲基纖維素與0.2%~0.4%葡萄糖酸鈣組成的水溶液，上述水溶液pH為7~8。

2.按照權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒，其特徵是：所泛影酸鈉-聚蔗糖400^#由0.3％～1.5％泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400^#組成的水溶液，該水溶液pH值為7～8。

3.按照權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒，其特徵是：所述細胞保養液為磷酸緩衝液或生理鹽水。

4.一種如權利要求1所述的有核細胞體外分離試劑盒的應用方法，其工藝過程為：首先用細胞保養液將骨髓或臍帶血稀釋，然後與紅細胞沉澱劑混勻，靜置8～20分鐘後收取上清液，離心濃縮，濃縮液再加入泛影酸鈉-聚蔗糖400^#或HISTOPAQUE1077後離心分離20～30分鐘，吸取有核細胞層，用細胞保養液清洗1～4次即可。 ^[1] 

試劑盒組成：

1、紅細胞沉澱劑：0.4％的羧甲基澱粉與0.4％葡萄糖酸鈣組成的水溶液，溶液pH值7.4；

2、泛影酸鈉-聚蔗糖400^#：0.3％的泛影酸鈉和8％的聚蔗糖400^#組成的水溶液，其pH值為7。

3、細胞保養液：磷酸緩衝液（PBS）；

上述三種液體配製後經過121℃，35分鐘滅菌，測試內毒素含量≤0.5EU/毫升，後分別存放在試劑盒中。

取100毫升骨髓或臍帶血，加100毫升細胞保養液稀釋，加20毫升紅細胞沉澱劑混勻後靜置8～20分鐘，收取上清液，以1200轉/8分鐘的速率離心濃縮。吸取濃縮液加到含有泛影酸鈉-聚蔗糖400^#的離心管中，做密度梯度離心30分鐘，轉速控制在1200轉/分，吸取有核細胞層，再用細胞保養液清洗1～4次，用50毫升細胞保養液稀釋備用，取5微升用臭酚藍檢測細胞存活率.再取5微升進行細胞計數。

每100毫升骨髓或臍帶血分離的細胞總數不應少於2.6-5.9×10⁷個細胞。

上述濃度為質量濃度。 ^[1] 

試劑盒組成：

1、紅細胞沉澱劑：1.2％的羥乙基澱粉與0.2％的葡萄糖酸鈣加水溶解所得的溶解液，pH值8；

2、HISTOPAQUE1077；

3、細胞保養液：生理鹽水；

上述三種液體配製後經過121℃，35分鐘滅菌，測試內毒素含量≤0.5EU/毫升，後分別存放在試劑盒中。

具體應用方法同實施例1。

上述濃度為質量濃度。 ^[1] 

試劑盒組成：

1、紅細胞沉澱劑：0.8％的甲基纖維素與0.3％的葡萄糖酸鈣加水溶解所得的溶解液，pH值8；

2、泛影酸鈉-聚蔗糖400^#；

3、細胞保養液：磷酸緩衝液（PBS）；

上述三種液體配製後經過121℃，35分鐘滅菌，測試內毒素含量≤0.5EU/毫升，後分別存放在試劑盒中。

具體應用方法同實施例1。

上述濃度為質量濃度。 ^[1] 

2014年11月6日，《一種有核細胞體外分離試劑盒及其應用方法》獲得第十六屆中國專利優秀獎。 ^[3]