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逆轉錄PCR
鎖定
- 中文名
- 逆轉錄PCR
- 外文名
- reverse transcription PCR
- 別 名
- 逆轉錄聚合酶鏈式反應
- 性 質
- 聚合酶鏈式反應廣泛應用的變形
- 模 板
- 一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA
- oligo
- 多聚體,相當於mRNA引物
- AMV RT
- 禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶
逆轉錄PCR技術介紹
由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA(cDNA)稱作“逆轉錄”,由依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉錄酶)來完成。隨後,DNA的另一條鏈通過脱氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成,隨每個循環倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解,留下互補DNA。
RT-PCR的關鍵步驟是在RNA的反轉錄,要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質等雜質。常用的反轉錄酶有兩種,即鳥類成髓細胞性白細胞病毒(avian myeloblastosis virus,AMV)反轉錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒(moloney murine leukemia virus,MMLV)反轉錄酶。
在完成逆轉錄過程之後,通過PCR進行定量分析的時候,隨着技術的發展,real-time PCR(實時熒光PCR)或ddPCR(數字PCR)技術也被用來做定量分析,它們比普通PCR進行定量分析時靈敏度更高,定量更精確。
逆轉錄PCR相關試劑
oligo:多聚體,相當於mRNA引物
AMV RT:禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶
MMLV RT:莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶
dNTPs:脱氧核苷酸
PCR Buffer:RT-PCR緩衝液
逆轉錄PCR各步驟的目的
預變性
破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結構。使DNA充分變性,減少DNA複雜結構對擴增的影響,以利於引物更好的和模板結合,特別是對於基因組來源的DNA模板,最好不要吝嗇這個步驟。此外,在一些使用熱啓動Taq酶的反應中,還可激活Taq酶,從而使PCR反應得以順利進行。
三種循環
延伸時間原因
用PCR儀擴增時,變性-退火-延伸循環完成後,繼續72度延伸了10分鐘的原因:
2、根據延伸速率推得,擴增1kb以內的DNA片段1min即可,而3-4kb則需要3-4min,依次照推。通常在最後一輪要適當的將延伸時間延長至4-10min,這樣做是使PCR反應完全以提高擴增產量。
3、繼續72度延伸了10分鐘除了可以使PCR反應完全以提高擴增產量外,還有一個作用是:在用普通Taq酶進行PCR擴增時在產物末端加A尾的作用,可以直接用於TA克隆的進行。
PCR引物的選擇
注意事項
(1)雙鏈DNA的變性温度是由雙鏈中C+G的含量決定的,C+G含量越高,模板DNA的溶解温度就越高。在選擇的變性温度下,模板鏈越長變性所需時間就越長。如果變性温度過低或變性時間過短,會使僅僅富含A+T區域變性。當模板DNA的G+C含量超過55%的時需要更高的變性温度。
(2)復性過程採用的温度至關重要如果復性温度太高,寡核苷酸引物不能與模板很好的復性,擴增效率將會降低。如果復性温度太低,引物將產生非特異性復性,從而導致非特異性的DNA片段的擴增。復性通常在比理論計算的引物和模板的溶解温度低3—5℃的條件下進行。
(3)PCR擴增所需的循環數目決定於反應體系中起始的模板拷貝數以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應進入幾何級數的增長期,反應會一直持續下去,直至某一成分成為限制因素。從這一點上來説,擴增產物中絕大多數應該是特異性的擴增產物,而非特異性的擴增產物應該低到難以檢測到的程度。用TaqDNA聚合酶(效率為0.7)在一個含有10的5次方個拷貝的靶序列的反應體系中進行30個循環後往往可以做到上述的理想情況。
逆轉錄PCR常見問題
(一)RT-PCR靈敏度:在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產物。 | |
可能原因 | 解決方案 |
RNA被降解 | 在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA。 使用良好的無污染技術分離RNA。 在將組織從動物體取出後立刻處理。 |
RNA中包含逆轉錄抑制劑 | 通過乙醇沉澱RNA除去抑制劑。用70%(體積分數)乙醇對RNA沉澱進行清洗。可以加入糖元(0.25μg/μL到0.4μg/μL)以幫助小量樣品RNA的恢復。 逆轉錄抑制劑包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸鈉,亞精胺,甲酰胺和胍鹽。 將對照RNA同樣品混合,同對照RNA反應比較產量以檢驗抑制劑。 |
用於合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火 | 確定退火温度適合您的引物。對於隨機六聚體,建議在反應温度保温之前先在25℃保温10min。 對於基因特異性引物(GSP),可以試一下其他GSP,或換用oligo(dT)或隨機六聚體確定GSP是反義序列。 |
起始RNA量不夠 | 增加RNA量。 |
RNA模板二級結構太多 | 將RNA和引物在不含鹽及緩衝液的條件下變性/退火。 提高逆轉錄反應温度。 注意:不要在>60℃時使用oligo(dT)引物,選擇一個在反應温度可以退火的GSP。 對於>1kb的RT-PCR產物,保持反應温度≤65℃。 |
(二)RT-PCR特異性:在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預期條帶。 | |
可能原因 | 解決方案 |
富含G+C的模板 | 對於G+C含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。 |
鎂離子濃度太低 | 從1mmol/L到3mmol/L,間隔0.5mmol/L進行一系列反應,確定對於每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。 |
引物和模板非特異性退火 | 在第一鏈合成中使用GSP,而不是隨機引物或oligo(dT)。試用允許高温cDNA合成的GSP。 |
RNA中沾染了基因組DNA | 使用擴增級DNaseⅠ處理RNA。使用沒有逆轉錄的對照反應檢測DNA污染。 |
(三)PCR忠實性:PCR在產物序列中引入了錯誤。 | |
可能原因 | 解決方案 |
聚合酶忠實性低 | 使用帶有校正活性的熱穩定聚合酶。 |
循環數太多 |